本文要点：为实现精准疾病诊断，高发光效率的荧光探针至关重要。为克服近红外二区（NIR-II）有机染料长期存在的量子产率低的局限，本文巧妙地设计了一种聚集诱导发光（AIE）发光体TPE-Hexoxyl。通过协同抑制π-π堆积并最小化分子内电荷转移，构建出NIR-II纳米颗粒，其亮度位居已报道有机探针之列（绝对荧光量子产率ΦPL = 0.9%）。体外研究表明，TPE-Hexoxyl纳米颗粒具有优异的胶体稳定性与显著的光稳定性。活体成像显示其具备高空间分辨率与长效组织滞留能力，可实现对全身血管系统、脑微血管网络及淋巴系统的动态高对比度可视化。尤为突出的是，TPE-Hexoxyl纳米颗粒在原位4T1荷瘤小鼠模型中对肿瘤病灶的检测灵敏度显著提升，并能精确绘制炎症性肠病模型中炎症区域的空间分布，凸显其在临床病理诊断中的变革性潜力。本研究确立了一种用于设计高亮度有机NIR-II荧光团的分子调控范式，为后续临床诊断应用提供了先进的分子工具。

方案1. 制备及体内应用NIR-II AIE NPs（TPE-Hexoxyl NPs）用于生物影像

在本研究中，通过引入三苯胺（TPA）和四苯乙烯（TPE）作为分子转子、3,4-双（2-乙基己氧基）噻吩作为π桥以及苯并[1,2-c:4,5-c]双[1,2,5]噻二唑（BBTD）作为电子受体，合理设计了两种新型D−π−A−π−D型近红外二区（NIR-II）聚集诱导发光（AIE）探针TPA-Hexoxyl和TPE-Hexoxyl。值得注意的是，选择3,4-双（2-乙基己氧基）噻吩作为π桥至关重要，因为其两个2-乙基己氧基链显著增加了分子的空间位阻。这种增加有效地减少了所得荧光团中的π-π堆积，从而提高了聚集态下的ΦPL。与基于TPA的同类探针相比，TPE部分显著减弱了扭曲内旋转（TICT）效应，从而大幅提高了ΦPL。经两亲性聚合物包覆后，TPE-Hexoxyl纳米颗粒（NPs）-1在极性水溶液中表现出极高的相对ΦPL，高达3.67%（以IR-26为参照，ΦPL=0.05%），绝对ΦPL为0.9%，凸显了其在生物成像应用中的卓越潜力。TPE-Hexoxyl NPs的卓越亮度使其能够对深部组织（包括全身血管系统、脑血管系统和淋巴网络（淋巴结/血管））进行高分辨率成像。此外，该探针在精确映射4T1原位肿瘤和炎症性肠病模型方面表现出色（方案1），为超灵敏体内疾病诊断建立了一套多功能工具。

图1. TPA-Hexoxyl和B)TPE-Hexoxyl的分子结构及表征

TPA-Hexoxyl和TPE-Hexoxyl化合物以TPA和TPE作为分子转子和电子供体合成（图1A,B）。两种化合物均具有典型的D−π−A−π−D结构，其中BBTD作为强电子受体。

为阐明其电子性质，进行了密度泛函理论（DFT）计算。优化后的基态（S₀）几何结构显示，最高占据分子轨道（HOMOs）主要定域于噻吩π桥和BBTD核心，而最低未占据分子轨道（LUMOs）则集中于BBTD核心（图1C）。尽管TPE单元的电子供体能力弱于TPA，导致TPE-Hexoxyl的HOMO-LUMO能隙（1.61 eV）略大于TPA-Hexoxyl（1.33 eV），但减弱的D−A相互作用有效缓解了TICT效应，从而保证了较高的量子产率。如图1D所示，TPE-Hexoxyl在S₀与激发态（S₁）之间存在显著结构差异，均方根偏差（RMSD）为11.2 Å，表明光激发后发生明显几何变化。这种大偏差由激发诱导的电子重排驱动，导致显著的结构弛豫，涉及键长、键角及整体构象的大幅位移。

光物理表征表明，两种化合物在500–850 nm范围内具有强吸收，并在900–1200 nm区域表现出强荧光发射，凸显其在NIR-II成像中的潜力（图1E）。此外，TPE-Hexoxyl在聚集态下展现出显著增强的NIR-II荧光，表明非辐射衰减被有效抑制。在THF/水混合溶液中的聚集行为显示，尽管两种化合物在THF中荧光微弱，但随着水含量增加，其发射显著增强，表现出典型的聚集诱导发光（AIE）特征（图1F）。为评估其TICT效应，研究了两种分子在不同溶剂中的光谱特性。值得注意的是，TPE-Hexoxyl的发射强度下降程度低于TPA-Hexoxyl，表明其TICT效应弱于TPA-Hexoxyl。

为提升其在生物成像中的适用性，采用生物相容性两亲性聚合物DSPE-mPEG2K作为载体，通过纳米沉淀法制备了水分散性纳米颗粒（NPs）。动态光散射（DLS）与透射电子显微镜（TEM）分析表明，TPE-Hexoxyl NPs与TPA-Hexoxyl NPs均呈球形胶束结构，流体动力学直径分别为72 nm和98 nm（图1G），在水溶液中Zeta电位分别为−20 mV和−21 mV（图1H）。如图1I所示，两类纳米颗粒的荧光强度较其单分子溶液显著增强，凸显其聚集诱导发光（AIE）特性。

图2. 体外近红外二区荧光成像、组织穿透深度及生物相容性评估

TPE-Hexoxyl NPs在不同浓度下的NIR-II荧光强度（伪青色）通过小动物成像系统捕获。图像显示荧光强度随浓度增加而增强，可在宽浓度范围内实现成像应用。在不同长通（LP）滤波器（1000−1250 nm）下亦观察到明亮发射，但波长越高，强度越低（图2A）。为定量评估组织穿透能力，使用808 nm激光激发体外组织模拟仿体（鸡胸组织），并采用优化的NIR-II成像参数（1000 nm LP滤波器、8000 mA电流、200 ms曝光时间）。如图2B、C所示，TPE-Hexoxyl NPs的荧光强度随组织厚度呈指数衰减，在50 mm穿透深度时接近背景水平。这种增强的组织穿透能力源于纳米颗粒的高ΦPL与NIR-II光谱窗口固有的生物光子学优势之间的协同作用，即散射系数降低和自体荧光抑制。

在开展体内研究前，系统评估了TPE-Hexoxyl NPs的生物安全性，包括其在808 nm激光照射（57.9 mW cm⁻²，5 min）下的光热性能。光热实验表明，即使浓度高达200 µM，TPE-Hexoxyl NPs仅引起温和的温度升高（ΔT ≈ 3 °C），表明其光热加热效应可忽略不计。在此基础上，使用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、小鼠胚胎成纤维细胞（3T3）和小鼠成纤维细胞（L929）进行的细胞毒性实验显示，在浓度高达100 µM时，未观察到显著细胞毒性（细胞存活率 > 95%）或对这些正常细胞增殖的抑制作用（p > 0.05）（图2D）。这些结果证实了TPE-Hexoxyl NPs优异的生物相容性。

溶血实验进一步揭示了其卓越的血液相容性：在100 µM浓度下，溶血率为1.20% ± 0.04%（图2E），显著低于ISO 10993–4国际标准规定的5%安全阈值。通过尾静脉注射对正常小鼠进行药代动力学评估显示，给药后1小时内血浆浓度迅速下降（图2F），归因于纳米颗粒快速的全身分布能力，有效减少了局部组织蓄积引起的系统毒性并缩短了代谢周期。这一快速分布特性为高亮度AIEgen的体内生物成像提供了显著优势。基于模型计算的关键药代动力学参数如下：消除半衰期（t₁/₂）为45.922 h，平均滞留时间MRT(0-t)为11.511 ± 1.331 h，药物暴露量AUC(0-t)为6841.188 ± 582.429 mg·L⁻¹·h⁻¹。

图3. 血管网络和淋巴结的体内近红外二区（NIR-II）荧光成像

在TPE-Hexoxyl NPs表现出良好生物相容性及优异的体外NIR-II成像潜力的基础上，本文进一步评估了其在健康小鼠中的血管成像与淋巴结可视化性能。纳米颗粒通过尾静脉注射给药（200 µL，1 mM浓度）。为更清晰地揭示微血管成像趋势，开展了平行实验（N = 7）。成像采用配备1000、1100、1200、1300、1400和1500 nm长通（LP）滤波器的InGaAs相机，记录腹侧与背侧方向的血管造影特征（图3A）。成像结果清晰展现了全身血管网络，后肢微血管及动静脉间组织结构在穿透皮肤与组织层后仍可明确分辨，凸显了高荧光强度对成像质量的关键作用。随着LP滤波器波长增加，血管信号显著性与成像效能逐步提升。定量统计分析表明，后肢血管（以白色虚线标示）在1400 nm波长下成像性能最优，其平均半高宽（FWHM）最小（0.479 ± 0.029 mm），平均信背比（SBR）最高（10.649 ±1.935）（图3B、C）。该组间极小变异证实了成像结果的高度平行性。耳部毛细血管网络同样在1400 nm下获得最优FWHM与SBR指标（图3D）。头皮剥离后对脑微血管的进一步观察显示，使用1400 nm滤波器可清晰呈现小脑血管结构，包括表浅静脉、上矢状窦与横窦（图3E）。足垫注射后5分钟内，纳米颗粒在内侧腘淋巴结与坐骨淋巴结区域显著富集（图3F）。关键的ICG共示踪实验表明，纳米颗粒与经典淋巴示踪剂在淋巴管、腘淋巴结及坐骨淋巴结中的分布模式近乎一致，证实了其强大的淋巴结靶向能力。综上，这些结果充分验证了TPE-Hexoxyl NPs在体内NIR-II荧光成像中的应用潜力。

图4. TPE-Hexoxyl纳米颗粒在原位乳腺癌小鼠模型中的体内近红外二区荧光成像

肿瘤成像在癌症诊疗一体化中发挥着关键作用，增强渗透与滞留（EPR）效应使纳米颗粒能够实现肿瘤特异性富集，从而支持精准诊断。 在全面评估TPE-Hexoxyl NPs在健康小鼠全身血管网络与淋巴结的NIR-II荧光成像性能后，本文进一步构建了原位4T1乳腺癌模型，以评价其体内肿瘤靶向能力。如图4A所示，通过NIR-II荧光成像系统（激发波长：808 nm，发射滤光片：1000 nm LP，电流值：3000 mA）进行实时监测，揭示了静脉注射纳米颗粒在肿瘤部位的时间依赖性富集特征。定量分析（图4B）表明，肿瘤荧光强度在48 h达到峰值，随后逐渐下降；值得注意的是，强荧光信号可持续至192 h，仅较峰值强度降低37.28%，从而证实TPE-Hexoxyl NPs具有卓越的肿瘤靶向能力与长效滞留特性。为明确生物分布特征，于注射后192 h处死小鼠进行离体分析。切除肿瘤及主要器官的荧光成像（图4C）结合半定量区域兴趣评估（图4D）显示，纳米颗粒在肿瘤组织、肝脏和脾脏中呈现显著富集。该分布模式在机制上与网状内皮系统（RES）介导的纳米颗粒截留及肿瘤特异性EPR效应的协同作用一致。至关重要的是，对肿瘤组织及主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色切片进行组织病理学检查，未观察到炎症浸润、细胞空泡化或坏死等病理改变，组织结构完整，进一步佐证了该纳米平台良好的生物相容性。

图5. 炎症性肠病小鼠模型中TPE-Hexoxyl纳米颗粒的体内近红外二区荧光成像

TPE-Hexoxyl在乳腺癌NIR-II成像中展现出卓越病灶靶向能力的基础上，接着利用右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的炎症性肠病（IBD）小鼠模型，探究该纳米平台在体内的炎症靶向特异性。如图5A所示，BALB/c小鼠被随机分为DSS诱导组（N = 4）和对照组（N = 4）。模型组小鼠连续8天自由饮用含3%（w/v）DSS的饮水，随后改用普通饮水恢复4天，以模拟疾病进展与缓解过程；对照组小鼠在整个实验期间均饮用普通饮水。每日监测显示，DSS处理组小鼠自第4天起出现进行性体重下降，至第8天体重降至对照组的81.02%（p < 0.001），并伴有明显血便（图5B、C），证实IBD模型成功建立且具备典型临床表型。所有小鼠于第10天经尾静脉注射200 µL、1 mM的TPE-Hexoxyl NPs。为精确解析信号空间分布，在处死后48 h进行离体NIR-II荧光成像（1000 nm LP滤光片），并使用InGaAs相机系统对两组小鼠的结肠组织进行系统性成像分析。

离体肠道NIR-II成像显示，两组小鼠的小肠段均未检测到显著荧光信号（图5D）。特异性荧光信号主要定位于结肠壁组织，通过Image J软件进行定量分析证实，DSS处理组结肠的NIR-II信号强度显著增强（图5E、F）。值得注意的是，DSS诱导的结肠炎导致结肠显著缩短（7.0 ± 0.5 cm vs 8.9 ± 0.4 cm，p < 0.05，图5F），这一宏观指标反映了炎症性水肿、免疫细胞浸润及组织损伤的严重程度。从高荧光强度区域精确采集的结肠组织切片进行组织病理学评估进一步验证了上述结果：DSS处理组结肠呈现典型炎症改变，包括密集的炎症细胞浸润、隐窝结构紊乱及广泛的上皮溃疡，而对照组肠道组织结构保持完整（图5G）。这些发现共同确立了一种基于可视化精准评估炎症性肠病（IBD）的新型分子成像工具。

参考文献

Lin D, Huang W, Yang H, et al. Ultrabright NIR‐II Nanoparticles for High‐Resolution In Vivo Imaging: From Systemic Vasculature Visualization to Pathological Microenvironment Monitoring[J]. Advanced Materials, 2025: e10493.

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