基于CDE指导原则的体内CAR-T产品相关杂质类型及风险
2026-02-13 来源:CellTech细胞技术与生产 点击次数:35本文来源于微信公众：CellTech细胞技术与生产 作者： Leo
一、引言
本文结合 CDE《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》要求，聚焦慢病毒载体（LVV）介导的体内 CAR-T 产品，重点分析核心产品相关杂质的类型、风险，以及稳定包装细胞系（稳转细胞系）在杂质控制中的关键作用与实施策略，为产品药学研究与申报提供技术支撑。
二、体内 CAR-T LVV 核心产品相关杂质类型及风险
根据 CDE 指导原则，产品相关杂质指生产或贮存过程中产生的非预期、无功能形式产物，其存在可能引发免疫毒性、脱靶效应、致癌风险等安全问题，体内 CAR-T LVV 的关键杂质及风险如下表所示：
| 杂质类别 | 具体形式 | 核心风险 | CDE 指导原则核心要求 |
| 非完整包装颗粒 | 空壳病毒颗粒、无包膜颗粒、缺失 CAR 表达框 / 逆转录酶等关键元件的颗粒。无靶向性分子病毒。 | 1. 无转导活性，竞争靶细胞结合位点，降低有效剂量；2. 诱发非特异性免疫反应，引发炎症因子风暴；3，非T细胞识别，导致错误转导。 | 需建立定性定量方法（如 TEM、NTA），严格控制空壳率；需建立纳米纳米流式检测方法，严格控制靶向分子阳性率，并保证批次一致。 |
| 错误包装颗粒 | 包装宿主基因组 DNA/RNA、质粒骨架序列、非目的 CAR 片段的病毒颗粒 | 1. 脱靶转导正常细胞，导致异常蛋白表达；2. 宿主 DNA 插入基因组引发插入突变，增加致癌风险 | 开展包装特异性分析，控制非目的序列包装效率 |
| 序列异常颗粒 | CAR 序列缺失、重排、点突变及载体 - 宿主基因杂交产物 | 1. CAR 功能丧失或异常（如持续激活）；2. 免疫原性增强，引发抗 CAR 免疫反应；3. 潜在致癌风险（如原癌基因激活） | 对序列杂质进行定性定量，评估变异频率与安全性 |
| 可复制型慢病毒（RCL） | 重组产生的具备自主复制能力的慢病毒 | 1. 体内持续复制，引发全身性感染； 插入突变风险显著升高； 诱发严重免疫病理反应 | 建立多阶段 RCL 检测体系，终产品需确认 RCL 未检出 |
| 聚集 / 降解产物 | 病毒颗粒聚集体、LVV RNA 降解片段、衣壳蛋白降解产物 | 1. 降低有效滴度，影响体内分布与转导效率；. 聚集体引发免疫复合物沉积，导致器官损伤； 降解产物激活 TLR 通路，诱发炎症反应 | 评估聚集与降解动力学，控制贮存条件与货架期杂质水平 |
三、稳转细胞系在杂质控制中的核心作用及解决方案
CDE 指导原则强调 “源头控制” 是杂质管理的关键，稳转细胞系通过替代传统瞬时转染工艺，从生产源头抑制杂质产生，同时优化过程控制，成为体内 CAR-T LVV 杂质控制的核心技术手段，具体作用与实施策略如下：
（一）稳转细胞系对核心杂质的源头抑制机制
1、降低非完整包装颗粒与错误包装颗粒
传统瞬时转染工艺中，质粒比例失衡、转染效率波动易导致空壳颗粒（无基因组 RNA）或错误包装颗粒（包装宿主 DNA / 质粒骨架）增多。稳转细胞系通过将转移质粒（含 CAR 序列）、包装质粒（gag/pol、rev）、包膜质粒（VSV-G），靶向质粒稳定整合至宿主细胞基因组，实现目的基因的持续、均衡表达。
稳转细胞系经克隆筛选与驯化，仅保留符合要求的高包装特异性的单克隆细胞，减少非目的序列（如宿主 DNA、质粒骨架）的包装概率，错误包装颗粒比例可控制在 0.1% 以下，显著降低脱靶转导与插入突变风险。
稳转细胞系采用自失活（SIN）型 LVV 载体设计，删除 3’LTR 增强子 / 启动子区域，降低载体与宿主基因重组概率；同时通过密码子优化 CAR 序列，消除重复序列与剪切位点，进一步降低突变杂质产生。
稳转细胞系通过严格的克隆筛选，剔除潜在的重组细胞克隆，且生产过程中无需反复转染质粒，避免了瞬时转染中质粒重组引发的 RCL 风险。
3、减少聚集 / 降解产物的产生稳转细胞系的培养工艺可实现规模化放大，生产过程中细胞密度与病毒释放效率稳定，避免了瞬时转染中细胞过度生长导致的营养缺乏与病毒降解，延长了病毒颗粒的稳定性。
（二）纯化工艺
即使在AAV领域已经有较多填料被开发出来，可以去除AAV的产品相关杂质，但是在LVV领域，还没有合适的可以规模放大的纯化手段，能够去除LVV产品相关杂质。这进一步依赖，从源头上设计与开发上，来降低产品相关杂质的产生。
四、结论
稳转细胞系通过源头抑制非完整包装、错误包装、序列异常等核心杂质的产生，显著降低 RCL 等高危杂质的风险，是体内 CAR-T LVV 产品杂质控制的关键技术手段。结合下游纯化工艺优化与严格的质量控制体系，可实现 “源头控制 - 过程去除 - 终点质控” 的全链条杂质管理，满足 CDE 指导原则对体内基因治疗产品的高纯度与安全性要求。