本文来源于微信公众： 生物研发笔记 作者：老周

IL-9R CAR-T
不久前，《Immunity》在同一天上线了两篇有关IL-9信号通路增强CAR-T疗效的文章，通讯作者分别是CAR-T之父Carl H. June和Anusha Kalbasi。有意思的是，早在2022年，两人就已经合作在《Nature》上发表了一篇《利用合成IL-9受体增强过继性细胞疗法》的文章，今天我们就一起打包学习一下吧。

01研究背景与问题
过继性细胞疗法，如CAR-T、TCR-T，虽然已经在血液瘤领域取得了显著效果，但在治疗实体瘤时疗效有限。主要障碍包括：
（1）免疫抑制性的肿瘤微环境（TME）：导致CAR-T细胞难以浸润和存活
（2）体内扩增和持久性差：输入的T细胞在体内难以有效扩增和长期存活。
（3）T细胞功能耗竭：即使T细胞能够扩增，也容易产生终末分化和功能失调。
（4）对预处理化疗的依赖：通常需要先进行淋巴清除化疗（一种有毒性的方案，限制了患者适用性）来为输入的T细胞创造“空间”和细胞因子环境。

02正交嵌合IL-9受体 CAR-T
过继性T细胞疗法需要“清淋”的一个主要原因是为输入的T细胞创造生长的空间，避免宿主细胞过度消耗IL-2等细胞因子。如果设计一种细胞因子，能特异性识别并促进过继性T细胞的生长就能略过“清淋”这一有害预处理，这即是正交受体的概念。

设计原理：
2022年，研究团队设计了一种全新的合成细胞因子受体系统，即正交合IL-9受体，把正交IL-2受体（o2R）的胞外域（ECD，负责与配体结合）与共同γ链细胞因子受体（如IL-4R, IL-7R, IL-9R, IL-21R）的胞内域（ICD，负责信号传导）进行融合。这样，改造后的T细胞表达的嵌合受体只能被相应改造的正交IL-2（oIL-2）激活，而不会被体内的天然IL-2激活，实现了对输入T细胞的“选择性”调控。

主要发现：
该研究发现，在测试的多种嵌合受体中， o9R（oIL-2R ECD + IL-9R ICD）T细胞表现尤为突出。它能够同时激活STAT1、STAT3和STAT5信号通路，这是一种独特的信号组合,使T细胞表现出更好的抗肿瘤特性：
（1）获得干细胞记忆T细胞（Tscm）表型：o9R信号诱导T细胞高表达CD62L、CD95（Fas）和Sca-1等Tscm细胞的标志，这类细胞具有更强的自我更新能力和持久抗肿瘤活性。
（2）增殖较少但功能更强：o9R T细胞体外增殖能力弱于o2R T细胞，但其杀伤活性和干扰素-γ（IFN-γ）的产生能力更强。
（3）独特的转录组特征：o9R信号赋予了T细胞一种“混合”表型，同时激活了与干细胞特性和效应功能/激活相关的基因，并下调了与T细胞功能障碍相关的基因（如Nr4a1, Tox）。这使其既能保持“年轻”状态，又具备强大的即时杀伤能力。
在胰腺癌模型中，研究采用了瘤内注射表达oIL-2的腺病毒（Ad-oIL-2）的方式，将细胞因子信号限制在肿瘤局部。CAR-o9R T细胞联合Ad-oIL-2展现了强大的抗肿瘤活性，即使在无预处理化疗的小鼠中也能引发相当比例的肿瘤完全消退，效果显著优于CAR-o2R T细胞。
在人类T细胞中，ho9R信号同样能诱导出Tscm表型。在经过多次肿瘤抗原反复刺激后，ho9R T细胞比ho2R T细胞能更好地维持干细胞特性，并产生更多细胞因子（如IFN-γ, TNF, IL-2），表现出更强的“多功能性”和持续杀伤能力。

03天然IL-R受体 CAR-T

理论基础：
与传统IL-2R、IL-15R、IL-21R等共同γ链细胞因子受体在体内广泛表达不同，IL-9R在正常组织（包括T细胞）中表达水平极低，这使其成为一个天然的正交型受体，更安全、更具靶向性

设计策略及原理：
以此发现为基础，两个研究团队分别将天然的IL-9R表达在肿瘤特异性的T细胞上（CAR-T，TCR-T），构造出CAR/TCR-IL9R T细胞。瘤内注射编码IL-9的腺病毒（Ad-IL-9）在肿瘤局部提供IL-9信号，或与重组表达的IL-9联合给药，能选择性激活并增强CAR-IL9R T细胞的功能。

Carl H June研究组主要发现：
● 卓越的抗肿瘤效果
（1）高效低剂量：极低剂量（低至3万个细胞）的CAR-IL9R T细胞联合Ad-IL-9，就能实现肿瘤的完全消退，其效果远优于需要百万级细胞量的传统CAR-T细胞。这大大降低了治疗所需的细胞剂量
（2）长期持久性与免疫记忆：在肿瘤被清除后，这些小鼠能够抵抗新一轮的肿瘤攻击，表明CAR-IL9R T细胞在体内形成了长期免疫记忆。（3）增强的肿瘤浸润与持久性：CAR-IL9R T细胞在血液和肿瘤中的扩增能力更强，存活时间更长（可达10周）。

● 优秀的抗衰竭能力
研究团队利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）等先进技术解析了IL-9信号如何重编程CAR-T细胞：
对CD8+ T细胞：IL-9信号能引导细胞朝向中央记忆和效应状态分化，同时远离终末耗竭状态。这使得CD8+ CAR-T细胞既能保持“年轻”、可长期存活的干细胞样特性，又具备强大的即时杀伤能力。RNA速度分析预测，IL-9处理的细胞会向功能状态演进，而对照组细胞则走向耗竭。
对CD4+ T细胞：IL-9信号促进其向具有增殖能力的效应状态发展，并偏向于产生抗肿瘤相关的Th1和Th9细胞亚型，这些细胞能分泌大量IFN-γ和TNF-α等关键抗肿瘤细胞因子。

● 抗原压力下维持CAR-T细胞功能
在体外模拟肿瘤微环境的持续抗原刺激实验中，IL-9信号帮助CAR-T细胞：
（1）维持表面CAR的表达：避免因抗原刺激导致的CAR分子丢失。
（2）保持CD4+和CD8+亚群的平衡。
（3）保留早期记忆表型，并表现出更强的细胞因子分泌和肿瘤杀伤能力

● STAT4介导的信号机制
研究发现，IL-9信号不仅能激活经典的STAT3和STAT5通路，还意外地、强效地激活了STAT4。STAT4传统上被认为是IL-12信号的关键介质，与Th1细胞分化和IFN-γ产生密切相关。通过CRISPR-Cas9技术敲除STAT4基因证实，STAT4是IL-9信号发挥增强作用（尤其是诱导IFN-γ产生）的关键分子。这表明IL-9通过激活STAT4，赋予了CAR-T细胞更优越的功能特性。

Anusha Kalbasi研究团队主要发现：
● 与Carl H June研究组的发现类似，Kalbasi团队也独立证明了工程化CAR/TCR-IL9R T细胞具有高效的抗肿瘤效果，能增强扩增与肿瘤浸润，同样地能诱导干细胞记忆T细胞（Tscm）表型--更强的正我更新能力与抗肿瘤活性。

● 机制研究发现，IL-9R信号能激活独特的STAT蛋白组合，除了已知的STAT1、STAT3和STAT5，还能强效激活STAT4，这就使IL-9信号具备了多种细胞因子的优点，即IL-12的效应功能（通过STAT4）、IL-2的增殖能力（通过STAT5）以及IL-21等的干细胞特性维持能力（通过STAT3），这种独特的混合信号优势是其赋予CAR-T卓越疗效的基础。

● 不同的是，该研究组又进一步深入探究了IL-9R信号强度与抗肿瘤效果之间的关系，发现了“金发姑娘原则（Goldilocks Principle）”,即IL-9R的信号强度存在一个最适窗口，过弱或过强的信号都会损害疗效。

研究团队通过结构生物学指导，对IL-9或IL-9R进行改造，分别削弱（如IL-9Q115T突变）或增强（如IL-9R3x/5x突变）其信号。结果表明，无论是信号减弱还是过度增强，都会削弱T细胞的抗肿瘤效果。这说明天然的IL-9/IL-9R信号强度本身就处于一个最优区间。

● 更进一步地，研究团队发现STAT1作为T细胞命运的“调节器”。通过精细设计IL-9R胞内域的单个氨基酸突变，研究团队成功“偏置”了其激活的STAT信号组合，特别是调控了STAT1的激活水平，发现：
（1）高pSTAT1（IL-9RPR突变）：驱动T细胞向终末效应细胞分化，增殖能力差，抗肿瘤效果不佳。
（2）低pSTAT1（IL-9RAQ突变）：促使T细胞维持干细胞样和记忆性状态，体内扩增能力极强，但效应功能稍弱。
（3）中等pSTAT1（野生型IL-9R）：使T细胞处于最佳平衡状态，同时具备强大的效应功能和持久的记忆潜力，因此抗肿瘤效果最好。

04总结与意义
两项研究相互印证又相互补充，系统性地将IL-9/IL-9R从一个相对“冷门”的细胞因子对，提升为下一代过继性T细胞疗法，特别是实体瘤治疗领域的一个极具前景的核心武器，是对抗实体瘤的一项突破性进展。它们从概念提出、机制深化到临床转化前景，构成了一个完整的研究体系，深化了我们对如何通过重编程细胞因子信号来优化T细胞命运的理解，为未来开发更智能、更有效的癌症免疫疗法指明了方向。
（1）实体瘤治疗新策略：首次将IL-9/IL-9R作为天然的“正交”系统用于增强工程化T细胞疗法，为克服实体瘤治疗障碍提供了强大、安全的新工具。
（2）阐明新机制：揭示了IL-9R信号意外激活STAT4这一全新机制，并阐明其通过最优的STAT信号强度和平衡（特别是STAT1的调节作用）来重编程T细胞命运，使其获得“超级”抗肿瘤能力。
（3）临床转化潜力：该策略在多种临床前模型中均显示卓越疗效，且采用临床可行的系统给药方式，为开发下一代针对实体瘤的T细胞疗法铺平了道路。