二代测序（NGS）平台正通过不断提升通量、降低测序成本，持续推动技术革新。这一趋势使得大规模基因组学研究中的主要瓶颈已从测序本身转移至文库制备环节。尤其是在群体规模基因组学与靶向测序应用中，传统手工文库制备方法仍面临流程繁琐、耗时久、成本高等现实挑战。

Twist 公司的FlexPrep™ 超高通量（UHT）文库制备与杂交捕获试剂盒凭借两项核心创新，能有效应对上述挑战。首先，Normalization by Ligation™（NBL）技术消除了在文库制备前对每个DNA样本进行定量和均一化（normalization）的要求，即能够将不同起始量的待测样本稳定转化为可测序文库；其次，在文库构建流程的前期便引入分子标签（barcode），使样本在连接反应后即可直接混合（pooling），从而大幅减少后续的实验流程步骤和反应体系，所需的耗材和试剂用量可节省高达12倍。这些创新设计使得每个靶向捕获反应可同时支持96个样品，在显著降低试剂消耗与人工操作时间的同时，充分提升了测序平台的运行效率。

在本实验中，我们使用了SPT Labtech的全自动移液工作站firefly® 来运行Twist FlexPrep UHT文库制备与杂交捕获实验流程。实验选用了384个来自牛基因组DNA（Sigma Aldrich 36231-M）的样品，并在384孔板的4个象限中分别投入了30、60、90和120 ng 4种不同的起始量，以此展现了firefly具有可拓展、无人值守化以及重复性高等特点，所得数据质量经验证与成熟的基因组分析方法结果相当。

将Twist FlexPrep超高通量（UHT）文库制备试剂盒、SPT Labtech公司的firefly平台和Element Biosciences公司的Trinity™ 测序化学技术相结合，并运用Twist Biosciences公司的牛基因组（Bovine DNA）捕获Panel实现了"杂交-测序同步化"的靶向捕获和富集。该工作流程为高通量基因组学研究提供了一个稳定可靠、灵活高效且具有显著成本优势的解决方案，能够在大规模样本队列研究中对已知或未知的新型基因进行高效检测和分析。

图1. 整合firefly平台与Element Trinity™技术的自动化文库制备、靶向富集及测序全流程示意图

本图展示了整合SPT Labtech firefly平台与Element Biosciences Trinity™测序仪内杂交捕获及测序的全流程。gDNA样本首先通过firefly平台在384孔板上进行片段化与连接反应，并借助12个内联条形码 （incline barcodes）在建库前期即实现样本混合。随后，混合文库在32个孔内（384/12=32）中完成连接后的纯化、PCR扩增及SPRI纯化，在维持文库质量的同时显著减少了试剂用量和人工操作时间。完成质控（QC）检测后，文库进入Trinity工作流程，探针杂交捕获直接在测序仪内的卡盒芯片上进行并完成测序。

FlexPrep™ NBL技术实现不同DNA起始量下稳定的文库产出


图2. FlexPrep™ Normalization by Ligation ™ (NBL) 技术可在宽泛的DNA起始量范围内实现稳定的文库产出

采用Twist Bioscience FlexPrep™ 超高通量文库制备试剂盒，对30至300 ng起始量范围内的基因组DNA进行文库normalization性能评估。图A：在不同DNA起始量下NGS测序reads数保持较高的均一性，从而避免繁琐的DNA定量步骤。图B: 在相同的DNA起始量范围内，插入片段大小中位数（median insert size）保持稳定，体现了NBL技术在实现文库产出均一化的同时，能够维持目标插入片段大小，并有效规避基于转座酶方法常见的性能问题。

FlexPrep™ UHT文库制备工作流程


图3. 传统酶切文库制备流程与Twist FlexPrep™ UHT超高通量工作流程对比

传统酶切文库制备流程与Twist FlexPrep™ UHT文库制备流程（96样本）对比示意图。传统流程中，从DNA稀释定量到片段化、连接、纯化、PCR及最终质控的每个步骤均需在独立的96孔标准实验反应体系中进行。相比之下，FlexPrep™ UHT流程在连接反应中引入了barcode，使样本可在首次SPRI纯化前完成混合。通过在前期将96个样品混合至8个实验反应体系，能够在确保文库质量与一致性的同时，显著减少试剂和耗材的消耗、人工操作时间及整体实验成本。

传统杂交捕获和Element Trinity™ 机内杂交的流程对比


图4. 传统杂交捕获流程与Element Trinity™测序仪内杂交工作流程对比

本示意图对比了常规外显子组与靶向Panel测序所用的传统杂交捕获流程（上）与Element Biosciences公司Trinity™测序仪机内杂交工作流程（下）。

传统杂交捕获需经历长时间的探针杂交、磁珠结合、多轮洗涤、杂交后扩增、文库质控及混合等步骤，随后才能进行上机测序。相比之下，Trinity技术流程直接将杂交探针加载至测序仪的芯片中，省去了磁珠捕获、洗涤及杂交后扩增环节，从而精简了靶向富集步骤。这一简化的工作流程在保持高效靶向富集与稳定测序性能的同时，显著减少了人工操作时间、缩短了实验周期，并降低了流程复杂度。

实验结果：文库质控（QC）数据


图5. 不同基因组DNA起始浓度下的最终文库产量

采用SPT Labtech firefly液体处理平台自动化运行的Twist FlexPrep™ 超高通量文库制备与杂交试剂盒所得到的最终文库产量（ng/μL）。

待测样本选取了牛基因组DNA，按四种起始浓度（30、60、90及120 ng）分置于384孔板的四个象限中，以评估该体系流程对不同DNA起始浓度下文库产出的稳定性。实验结果表明，所有起始浓度下均得到了相当均一的文库产量，体现了Twist NBL技术在均一化中的高效性。这些数据证实，在firefly平台上自动化运行Twist FlexPrep工作流程无需预先进行DNA定量与均一化处理，即可实现高度稳定的文库制备重复性。

图6. 不同gDNA起始浓度下文库片段大小的一致性

通过firefly自动化Twist FlexPrep™ UHT工作流程，在四种基因组DNA起始浓度（30、60、90和120 ng）下制备的文库所获得的平均片段大小（bp）。

所有起始浓度下的文库片段大小分布均保持一致，表明该流程体系具有稳定且可重复的片段化与文库制备能力，且不受起始样本量的影响。这种高度均一性保障了文库制备流程具备良好的可扩展性与高通量适用性，能够广泛支持下游杂交、靶向富集及测序等各类应用。

实验结果：测序性能指标


图7. Trinity™ 测序仪“机内杂交”的测序性能指标

采用Twist FlexPrep™ UHT文库制备流程、并通过Element Biosciences Trinity™测序仪进行机内杂交并测序，其靶向富集与测序性能指标展示。

所列指标包括：脱靶百分比、杂交文库大小、重复序列百分比、平均靶向覆盖深度、零覆盖靶标百分比及Fold-80碱基罚分。结果展示基于多个firefly自动化文库制备的混合样品批次。所有指标表现一致，表明整合的firefly–Twist–Element工作流程能够实现稳定的杂交效率、均一的靶向覆盖以及可重复的高质量测序。