概要
VPS4B（液泡蛋白分选相关蛋白4B）是减数分裂亚群AAA ATP酶家族（meiotic clade AA ATPase）成员，该类酶以寡聚体形式发挥功能，通过ATP水解驱动蛋白转运。VPS4B在某些癌症中过表达，且与其同源蛋白VPS4A存在合成致死关系，使VPS4B成为具有潜力的治疗靶点。本研究开发了一种基于VPS4B抑制剂的筛选与分析技术平台。该平台的核心是结合Transcreener^® ADP² Assay与SPT Labtech dragonfly^® discovery非接触式加样技术进行ATP酶活性测定，旨在通过流程优化，最大限度减少实验的不稳定，确保筛选结果的可靠且准确。

我们采用Transcreener^® ADP² FP成功检测了VPS4B ATP酶的初始活性，在100 nM酶浓度条件下，总偏振位移约150 mP。借助dragonfly^® discovery平台进行分液操作，在384孔板和1536孔板中测得的Z'因子分别高于0.9和0.8。针对1280种生物活性化合物进行的初步筛选显示阳性率为1%，干扰率为0.1%。其中一个阳性化合物在后续的剂量反应复筛实验中得到了进一步的验证，且手动分液与dragonfly^® discovery系统测得的IC₅₀值高度一致。 本研究证明，SPT Labtech的dragonfly^® discovery与Transcreener^® ADP² Assay联用，可为VPS4B抑制剂研发提供了一个稳定便捷的技术平台。

dragonfly^® discovery多功能分液工作站

图1. dragonfly discovery是一款基于固相置换原理的非接触式微量分液器

SPT Labtech 开发的dragonfly discovery分液系统能够在200 nL至4 mL的超宽量程范围内，实现高度精准且可重复的非接触式分液，即便处理高粘度试剂依然表现出色，适用于各类SBS标准微孔板（包括384孔和1536孔板）。其基于固相置换技术的零校准、低维护设计，可快速完成仪器配置与实验流程（protocol）设定，尤其适用于微缩化高通量筛选（HTS）。该系统不仅有助于节约珍贵试剂与耗材，还能有效提升检测体系的稳定性和数据可靠性。
其最多配备10个通道，每个通道既可完全独立运行，又可同步操作，从而实现快速且高度灵活的非接触式分液。这种设计不仅支持在高密度1536孔板中进行复杂的试剂梯度组合以完成方法学开发和验证，也能进行常规试剂的高通量和快速分装。

Transcreener^®ADP² Assay检测方法

图2. Transcreener ADP² Assay是一种基于远红光的竞争性检测方法，
通过定量ADP生成量来测定酶活性

Transcreener^®检测技术基于高度特异性抗体，在均相反应体系中直接识别与定量核苷酸，并通过远红外荧光输出检测信号。Transcreener^®检测专为高通量筛选设计，采用单次加样、混匀即读的实验模式，具备优异的试剂稳定性，且兼容各类主流多功能酶标仪品牌。该检测平台提供荧光偏振（FP）、荧光强度（FI）及时间分辨荧光能量共振转移（TR-FRET）三种检测模式。相较于依赖间接测量或多步操作的ADP检测方法，Transcreener^®流程更简化，具备更高的灵敏度与信噪比。其“加样混匀即读”的实验模式，结合试剂稳定的性能表现，使其尤其适用于自动化工作流程的整合与应用。
该技术采用简洁高效的实验原理，并使用了一种特异性识别ADP而非ATP的抗体及远红光荧光示踪剂。反应中生成的ADP与荧光示踪剂竞争结合抗体，通过改变荧光特性输出可读信号。

基于ADP² FP方法的VPS4B活性酶检测

图3. 实验验证

A. 在含有8 μM ATP的酶活检测缓冲液A（50 mM HEPES pH 7.5、10 mM MgCl₂、50 mM KCl、5 mM DTT、0.01% Triton）中，分别通过手动移液和dragonfly^® discovery平台对VPS4B蛋白进行梯度稀释，并在37℃条件下孵育2小时。B. 将酶活性转换为ADP生成量后拟合成标准曲线，证实手动移液与dragonfly^® discovery分液所测得的酶活反应速率具有良好的一致性。

基于ADP² FP方法的Z'因子测定

图4. 手动和dragonfly discovery实验结果比较

在12个数据点上，分别用384孔板（A）与1536孔板（B）测定了Z'因子。上半部分图表展示手动移液操作的Z’因子值；下半部分图表则为通过 dragonfly^® discovery 分液所得的Z’因子值。
 

VPS4B酶抑制剂初筛

图5. VPS4B ATP酶预实验筛选

采用Transcreener^® ADP² FP检测法对Tocris 2.0化合物库中的1280个化合物进行筛选，共鉴定出13个偏振值高于3倍标准差的潜在抑制剂；其中12个化合物对检测体系无干扰效应。

剂量反应曲线和IC₅₀分析

图6. 剂量反应分析

A. 从初筛中获得的阳性化合物ESI-09及对照化合物Suramin的剂量反应曲线，实验在384孔板中进行。其中，对照化合物Suramin的IC₅₀值在手动移液和 dragonfly^® discovery 平台上分别是B. 2.3 μM和C. 2.9 μM。

结论

• Transcreener^® ADP²检测技术采用均相荧光偏振法，可实现VPS4B酶活性的直接定量测定。

• 该技术与SPT Labtech的dragonfly^® discovery平台联用后，该检测体系展现出优异的数据质量（Z'因子持续高于0.8，信号窗口稳定），为高通量筛选流程提供了可靠支撑。

• 在384孔板和1536孔板中的验证实验表明，dragonfly^® discovery与Transcreener^®检测技术具有良好的板型适应性，在不同规格微孔板中均表现出高度可重复的稳定性能。

• 自动化非接触式分液功能显著简化了酶滴定、方法学开发及化合物库筛选等操作流程，有效提升了实验通量与数据稳定性。

• 初步筛选研究进一步验证了该检测体系在药物研发中的适用性，成功鉴定出多个VPS4B抑制剂并测得其IC₅₀值，结果可靠，充分展现了该方案在VPS4B及相关ATP酶研究中的应用潜力。