方案摘要：本方案覆盖猪口蹄疫3ABC-B-ELISA全试验流程，借助Fluidot自动移液工作站精准定量、自动化批量作业等核心优势，标准化优化批量加样、试剂稀释、精准分液等关键试验操作。设备具备高精度控量、匀速稳定吸排液、全程自动化运行的特点，可从根源规避手动加样误差、分液不均、操作时序不一等人工问题，有效降低长时间、大批量检测带来的人工劳作疲劳。大幅提升试验检测重复性与板间、孔间检测一致性，保障检测数据精准可靠、结果稳定可控，进一步规范标准化实验操作流程，高效支撑规模化口蹄疫血清筛查、抗体监测及流行病学监测等核心工作。
 
 
方案详情：
一、实验原理
3ABC-B-ELISA 为猪口蹄疫野毒鉴别检测方法，依托病毒非结构蛋白 3ABC 开展阻断反应。灭活疫苗免疫猪不产生 3ABC 抗体，仅野毒感染猪会特异性产生该抗体。试验以 3ABC 抗原包被酶标板，样本抗体与酶标单抗竞争结合抗原，通过显色程度判定结果，可快速区分疫苗免疫与野毒感染，常用于猪场疫病排查与流行病学监测。
1、器材
① Fluidot自动移液工作站及吸头；
② 酶标仪。
③ 与96孔酶标板配套使用的旋转振荡器。
④ 恒温培养箱。
⑤ 洗板机或洗涤瓶。
⑥ 96孔平底聚苯乙烯酶标板。
⑦ “U”型96孔稀释板。
⑧ 贮液槽。
⑨ 封板膜。
 
 
 
2、试剂
① 阴性对照血清；
② 阳性对照血清；
③ 弱阳性对照血清；
④ 25倍浓缩PBS缓冲液；
⑤ 3ABC蛋白捕获抗体；
⑥ 酶标检测抗体贮存液；
⑦ 血清稀释液；
⑧ ELISA用TMB底物溶液；
⑨ 终止液；
⑩ 捕获3ABC抗原反应板。
      
 
三、实验步骤
1、取出密封的捕获3ABC抗原反应板，所有的试剂在使用前应先恢复至15 ℃~25℃，通过涡旋振荡器轻振血清样品混匀。
2、将预处理完成的待测样品、各类试剂、实验孔板依次放置于Fluidot自动移液工作站的托盘与专属适配器中，并提前设置好设备参数。
 
3、设备自动拾取全新吸头，每孔精准加入80μL血清稀释液；随后设备自动更换全新吸头，依次向对应孔位加入20μL待测血清、阳性对照血清、弱阳性对照血清及阴性对照血清。其中待测样品单孔检测，阴性、弱阳性、阳性对照血清均设置平行双孔检测。加样完成后，振荡混匀，封口膜封口，在15℃~25℃环境条件下振荡孵育。检测牛、羊血清时孵育1h，检测猪血清时孵16h~20h。孵育结束后小心去除封口膜，每孔加入约300μL洗涤液洗板5次，最后一次洗板后充分拍干孔内残留液体。全程设备每完成一次加样操作均自动更换全新吸头，杜绝交叉污染。4、采用血清稀释液按照1:100比例稀释100倍浓缩酶标单抗，通过Fluidot自动移液工作站精准分液，每孔加入100μL稀释后酶标单抗溶液，加样完成后用封口膜封板，置于15℃~25℃环境中孵育1h。孵育结束后去除封口膜，每孔加入约300μL洗涤液洗板5次，最后一次充分拍干孔内残留洗液。
 
5、通过Fluidot自动移液工作站连续分液模式，向每孔精准加入100μL TMB底物溶液，加样完成后用封口膜密封酶标板，置于15 ℃~25℃避光环境中孵育10 min~15 min。
6、通过Fluidot自动移液工作站向每孔精准加入100μL终止液，全程加样匀速、等量，保障试验一致性。可在加终止液前检测OD630nm值，将数值控制在0.5~0.6之间，保证最佳检测效果，终止前OD630nm值约为终止后OD_630nm值的1/3。加终止液完成后，在450nm波长下测量并记录各样品及对照品的吸光值。
 
 
四、试验结果有效性判定
1、计算阴性、弱阳性与阳性对照血清平均OD_450nm值。根据公式计算测试样本(弱阳性、阳性对照血清与待测血清)阻断率(PI),PI=(1-测试样本OD_450nm值/阴性对照平均OD_450nm值)×100%。
2、结果有效性判定:阴性对照平均OD_450nm值应大于1.0，弱阳性对照血清阻断率应大于50%，阳性对照血清阻断率应大于70%，试验有效。
五、结果判定
试验结果有效，被检血清样品PI值大于或等于50%，判定为FMDV NSP3ABC抗体阳性；被检血清样品PI值小于50%，判定为FMDVNSP3ABC抗体阴性。