方案摘要：本方案针对猪口蹄疫固相竞争酶联免疫吸附试验（SPC-ELISA）全实验流程，依托Fluidot全自动移液工作站精准移液、微量匀速分液、批量自动化操作的核心性能优势，对实验中批量加样、样品梯度稀释、微量试剂精准加注等关键易误差步骤进行标准化优化。设备可全程自动化完成取吸头、精准吸排液、定量分液、废头丢弃全流程操作，彻底规避传统手动操作力度不均、移液速率不一、手部抖动、长时间操作疲劳等问题引发的孔间体积偏差与实验误差。大幅提升猪口蹄疫SPC-ELISA检测的重复性、孔间均一性与结果可信度。
 
 
 
方案详情：
一、实验原理
猪口蹄疫 SPC-ELISA 采用固相竞争酶联免疫吸附原理。将口蹄疫病毒抗原包被于固相载体，待检血清与酶标抗体同时加入，血清中特异性抗体与酶标抗体竞争结合固相抗原。洗涤后加入底物显色，待检抗体含量越高，显色越浅。通过吸光度值判定结果，可快速、定量检测猪血清中口蹄疫病毒抗体水平，适用于疫苗免疫评估与流行病学监测。
二、‌实验准备
1、器材
① Fluidot自动移液工作站；
② 酶标仪。
③ 与96孔酶标板配套使用的旋转振荡器。
④ 恒温培养箱。
⑤ 洗板机或洗涤瓶。
⑥ 96孔平底聚苯乙烯酶标板。
⑦ “U”型96孔稀释板。
⑧ 贮液槽。
⑨ 封板膜。
 
 
 
2、试剂
① 捕获抗体；
② 检测抗体；
③ 对照抗原、对照血清；
④ 被缓冲液；
⑤ 样品稀释液；
⑥ 酶标抗体稀释液；
⑦ 洗涤缓冲液；
⑧ 底物溶液；
⑨ 终止液；
⑩ 兔抗豚鼠IgGHRP标记物。
 
      
 
三、实验步骤
1、使用Fluidot自动移液工作站，预设好分液程序后设备自动拾取无菌吸头，向96孔酶标板每孔精准加入50μL经pH9.6碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的兔抗血清包被液。加样完成后，设备自动丢弃废吸头，封板膜封板，置于4℃环境下过夜。
 
2、用洗涤缓冲液洗板5次。
3、Fluidot自动移液工作站自动取用新吸头，向酶标板每孔精准加注50μL经pH9.6碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的FMDV灭活抗原。加样结束后设备自动丢弃废吸头，封板膜封板，置于4℃环境下过夜。
 
4、用洗涤缓冲液洗板5次。
5、提前预设2倍梯度稀释程序，Fluidot自动移液工作站自动拾取无菌吸头，在96孔U型稀释板中以50μL/孔的参数加入样品稀释液。对待检血清从1:4起始进行全自动2倍连续梯度稀释，每份待检血清均设置2个重复。然后整体平移至已包被抗体抗原复合物的ELISA反应板中。向每孔内加入相应的50uL同型酶标单抗工作液，封板混合后，置37°C孵育30min。加入酶标抗体工作液后血清的实际稀释度变为从1:8开始的2倍连续稀释度。
 
6、孵育结束后取出酶标板，进行5次洗板操作，彻底清除孔内未结合的血清与酶标抗体残留。使用Fluidot自动移液工作站，向每孔精准加入50μL TMB底物溶液，加样完成后自动弃头。将酶标板置于37℃恒温环境避光温育15min，完成显色反应。温育结束后，设备再次自动换新吸头，每孔精准加入50μL 2mol/L硫酸终止液终止显色反应，轻微振荡混匀，待数值稳定后上机检测。
 
7、对照设立:每次试验，每块板设8孔连续2倍稀释的阳性血清对照、2孔连续2倍稀释的阴性血清对照，以及不加血清稀释液的4孔酶标单抗对照。
 
四、试验成立条件
在酶标仪OD_450nm波长处，测定酶标板的每孔光吸收值，求出每份被检血清和同板酶标抗体对照的平均光吸收值。酶标抗体对照孔的OD_450nm值应大于1.0;阳性血清抗体滴度应在1:512~1:2048范围内;阴性血清对照滴度应小于1:8
五、结果判定

1. 以酶标抗体对照孔平均OD_450nm值的60%为临界值，被检血清OD_450nm值大于临界值的孔为阴性孔，小于或等于临界值的孔为阳性孔。以阳性孔的最高稀释倍数为被检血清的抗体滴度。
2. 被检血清抗体滴度大于或等于1:64判为阳性。被检血清抗体滴度小于或等于1:32判为阴性。被检血清抗体滴度介于1:32和1:64为可疑·需再次测定;若再次测定抗体滴度大于或等于1:64判为阳性，小于1:64判为阴性。