方案摘要：本方案围绕猪口蹄疫LPB-ELISA全流程，结合Fluidot自动移液工作站高通量自动化移液、自动梯度稀释、防交叉污染等优势，标准化优化批量加样、血清梯度稀释、微量试剂精准加注等关键操作。有效规避手动移液按压力度不均、移液速度差异、手部抖动、长时间作业疲劳带来的微量体积误差，消除人工加样孔间偏差，大幅提升整板实验重复性、加样均一性与批次稳定性，保障检测数据精准可靠，为规模化口蹄疫血清鉴别、病原批量筛查、区域流行病学常态化监测提供全自动、标准化、全流程可追溯的实验操作体系，全方位提升大批量样本检测效率、降低系统实验误差。
 
 
 
方案详情：
一、实验原理
猪口蹄疫 LPB-ELISA 即液相阻断 ELISA，原理是利用病毒抗原与酶标抗体竞争结合待检血清中的特异性抗体。血清先与病毒抗原充分反应，再加入包被在微孔板上的酶标抗体。若血清含中和抗体，会优先结合病毒抗原，阻断其与酶标抗体结合，显色变浅；无抗体则酶标抗体与抗原结合，显色较深。通过测定吸光度并计算阻断率，判定血清抗体水平，可快速评估口蹄疫免疫效果。
二、‌实验准备
1、器材
① Fluidot全自动移液工作站；
② 酶标仪。
③ 与96孔酶标板配套使用的旋转振荡器。
④ 恒温培养箱。
⑤ 洗板机或洗涤瓶。
⑥ 96孔平底聚苯乙烯酶标板。
⑦ “U”型96孔稀释板。
⑧ 贮液槽。
⑨ 封板膜。
 
 
2、试剂
① 捕获抗体；
② 检测抗体；
③ 对照抗原；
④ 被缓冲液；
⑤ 样品稀释液；
⑥ 酶标抗体稀释液；
⑦ 洗涤缓冲液；
⑧ 底物溶液；
⑨ 终止液；
⑩ 兔抗豚鼠IgGHRP标记物。
 
      
 
三、实验步骤
1、提前设置好分液程序，Fluidot自动移液工作站自动取8个吸头，将工作浓度的捕获抗体分别加入到ELISA板第1列至第12列(可根据待检样品数量后台编辑调整包被孔数),严格按O、A、Asia 1型的顺序分区自动包被酶标板，每个血清型精准包被1列，每孔定量加注50μL，作业完成后人工覆上封板膜，置于4℃过夜(或38℃±0.5℃,100 r/min~200 r/min振荡孵育2 h)。
 
2、使用Fluidot自动移液工作站，自动为酶标板每孔加满洗涤缓冲液，静置30s弃去，重复洗涤6次，结束后取出酶标板，在吸水纸巾上拍干。
3、工作站自动取两个吸头，在ELISA板第1列A、B两孔加O型抗原,更换吸头后在第2列A、B两孔加A型抗原，第3列A、B两孔加 Asial型抗原，以此类推，其余孔加被检样品，每份样品每个血清型加2孔，每孔加50uL。每型设2孔阴性对照,阴性对照孔每孔加50uL样品稀释液。用封板膜封板，置于38℃±0.5℃旋转振荡器中振荡60min，洗涤。
 
4、工作站将工作浓度的豚鼠抗FMDV各型抗血清逐个加入与包被兔抗FMDV血清同型的各孔，即包被兔抗O型FMDV抗血清的孔则加豚鼠抗O型FMDV抗血清，包被兔抗A型FMDV抗血清的孔则加豚鼠抗A型FMDV抗血清,以此类推，每孔加50uL，封板后同前振荡孵育60min。洗涤后加兔抗豚鼠IgG HRP标记物,每孔加50 uL，封板后同前振荡孵育45 min,洗涤。或者将工作浓度HRP标记的各型抗FMDV型特异性单克隆抗体加入到包被同型兔抗血清的各孔和阴性对照孔，每孔加50uL，封板后同前振荡孵育60min，洗涤。
5、加底物溶液、终止液，判读结果加豚鼠抗FMDV各型抗血清和兔抗豚鼠IgGHRP标记物时,洗涤板子后加入预热至38℃±0.5℃的OPD底物溶液,每孔加50uL，封板,避光38 ℃±0.5℃振荡孵育15 min。每孔加 50uL 1.25 mol/L终止液，混匀后在酶标仪492nm 下判读结果。加HRP标记的各型抗FMDV型特异性单克隆抗体时,洗涤板子后加入预热至38℃±0.5℃的TMD底物溶液，每孔加 50uL,封板，避光38 ℃±0.5 ℃振荡孵育15 min。每孔加50uL 2 mol/L硫酸终止液，混匀后在酶标仪450nm下判读结果。
四、试验成立条件
结果计算:相对OD值=被检样品各血清型平均OD值一同型阴性对照(N)平均OD值。
某型阴性对照(N)平均OD值＞0.20,试验不成立。
阳性对照OD值应≥0.6,阴性对照应≤0.20,试验成立。
五、结果判定

1. 在试验成立的前提下:如果样品各型的相对OD值≤0.20,则该样品为阴性;
2. 如果样品某型的相对OD值≥0.3.则判定该样品此血清型阳性;
3. 如果样品某型的相对OD值＞0.2但＜0.3,则判为可疑，需要重新测定,再次测定结果，若某型的相对OD值＜0.30,则该样品为阴性，如果样品某型的相对OD值≥0.3,则判定该样品该型口蹄疫抗原阳性。