主要技术
单细胞RNA测序（技术服务伯豪生物提供）

主要研究
1. AF6通过调控HNF4α抑制初级胆汁酸合成，敲除后抑制肝癌进展
Afadin（AF6）是一种在上皮组织中普遍表达的支架极性蛋白，支持细胞粘附、迁移、分化和存活。基于之前的研究，作者猜测AF6基因可能是调控肝组织胆汁酸合成的关键因子。因此对肝细胞特异性敲除Af6（AF6⁻/⁻）肝癌小鼠进行RNA测序分析及分子实验验证，结果显示AF6可与胆汁酸合成关键转录因子HNFα相互作用，通过核定位序列介导的核转位抑制HNF4α的转录活性，进而下调CYP7A1、CYP8B1、CYP27A1等初级胆汁酸合成限速酶的表达。AF6敲除后，这些酶的蛋白与mRNA水平显著上调，肝脏内牛磺胆酸（T-CA）、β-鼠胆酸（β-MCA）等初级胆汁酸浓度大幅升高。表型分析显示，AF6⁻/⁻小鼠肿瘤数量及肿瘤直径显著降低，肝脾重量等肿瘤负荷指标明显改善，该表型在水动力转染癌基因的多个肝癌模型中均得到验证；而过表达AF6会加速肿瘤发展并降低肝脏胆汁酸水平，证实AF6通过调控初级胆汁酸合成介导肝癌进展。

图1 AF6与HNF4α相互作用介导的胆汁酸合成改变影响肝癌进展

2. AF6敲除通过胆汁酸代谢重编程上调CXCL14 
作者重新分析AF6敲除肝癌小鼠的转录组数据，发现免疫相关通路显著激活，其中趋化因子编码基因CXCL14的上调幅度最为显著，qPCR与ELISA实验验证了AF6⁻/⁻小鼠肿瘤组织中CXCL14 mRNA高表达，且血清中CXCL14蛋白浓度显著升高，该结果在多种肝癌模型中均一致，而过表达AF6则会抑制CXCL14的表达，免疫荧光显示CXCL14在AF6⁻/⁻小鼠肿瘤边缘富集。为验证CXCL14的功能，作者通过腺相关病毒（AAV-TBG-Cxcl14）在AF6 flox/flox肝癌小鼠中肝特异性过表达CXCL14，结果显示肿瘤负荷显著降低，肿瘤数量与肝重比明显下降；而敲除AF6⁻/⁻小鼠的CXCL14会逆转AF6敲除的抑瘤效应，加速肝癌进展，表明CXCL14是受AF6负调控、介导肝癌抑制的关键抑瘤性趋化因子。此外，给予AF6flox/flox肝癌小鼠1%T-CA饮食可模拟AF6敲除的表型，显著抑制肿瘤进展并上调血清与肿瘤组织中的CXCL14，表明AF6调控的T-CA是CXCL14上调的重要上游信号。

图2 CXCL14 在抑制肝癌进展中发挥重要作用

3. 胆汁酸通过重塑肠道菌群使丁酸水平升高，丁酸经肠肝轴介导CXCL14上调
体外实验中，用T-CA、β-MCA等关键初级胆汁酸处理肝癌细胞系及患者来源肝癌类器官，并未直接诱导CXCL14表达，提示胆汁酸并非通过直接作用调控CXCL14。宏基因组测序显示，AF6⁻/⁻肝癌小鼠肠道菌群组成发生显著改变，双歧杆菌、粪杆菌、拟杆菌、乳杆菌等短链脂肪酸（SCFA）产生菌属显著富集，靶向代谢组学检测到小鼠肝脏中乙酸、丁酸等短链脂肪酸水平大幅升高。同时，AF6敲除后回肠与肝脏中ASBT、NTCP等胆汁酸转运体的表达上调，增强了肠肝循环，过表达AF6则会降低丁酸水平并抑制转运体表达，T-CA饮食可模拟AF6敲除的菌群与代谢物变化。体外功能实验证实，丁酸可显著上调肝癌细胞系及人、鼠肝癌类器官中CXCL14的mRNA与蛋白分泌水平，而乙酸、丙酸无此效应；体内实验中，给野生型小鼠补充丁酸可使血清中的CXCL14升高，给肝癌小鼠补充丁酸则显著抑制肿瘤进展，同时上调血清与肝脏CXCL14水平，证实胆汁酸通过重塑肠道菌群提升丁酸水平，丁酸是经肠肝轴介导CXCL14上调的关键中介。

图3胆汁酸代谢改变肠道菌群组成，菌群来源的丁酸通过肠-肝轴促进 CXCL14 的表达

4. CXCL14通过招募并激活树突状细胞塑造抑瘤性肿瘤微环境
为明确CXCL14的抑瘤机制，作者对AF6敲除肝癌小鼠肿瘤组织进行单细胞RNA测序。结果显示CXCL14主要由肝细胞表达，免疫荧光共定位实验进一步证实肝细胞是CXCL14的分泌来源。细胞间通讯分析显示CXCL14⁺细胞与树突状细胞（DC）、T细胞等免疫细胞存在强烈信号交互，流式细胞术检测发现AF6⁻/⁻小鼠肿瘤内DC细胞比例显著升高，而巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞无比例明显变化。Transwell 迁移实验证实，重组 Cxcl14 能有效诱导DC细胞的趋化作用，且经 Cxcl14 处理的DC细胞中MHC-II、CD80 和 CD86 的表达水平显著升高。体内耗竭实验中，用抗CD11c中和抗体耗竭AF6⁻/⁻小鼠的DC细胞后，肝脏丁酸与血清CXCL14水平未受影响，但AF6敲除的抑瘤效应完全消失，肿瘤数量与肝脾重量比显著回升，证实CXCL14招募并激活DC细胞，是塑造抑瘤性肿瘤微环境的核心环节。

图4 CXCL14 通过募集树突状细胞并增强其抗原提呈能力抑制肝癌进展

5. DC细胞介导CXCL14对CD8⁺T细胞的活化，AF6-BA-丁酸-CXCL14轴在人肝癌中具有临床相关性
肿瘤组织单细胞RNA测序结果中的T细胞重聚类。分析显示，AF6⁻/⁻小鼠肿瘤内效应增殖型CD8⁺T细胞亚群比例显著升高，该亚群为主要的细胞毒性CD8⁺T细胞群体。流式细胞术证实，AF6⁻/⁻小鼠肿瘤浸润CD8⁺T细胞的IFN-γ、TNF-α、GZMB等细胞毒性因子分泌增加，PD-1等耗竭标志物表达降低；体外共培养实验显示，CXCL14处理的DC细胞可显著促进CD8⁺T细胞的增殖与细胞毒性因子分泌，而直接用CXCL14处理CD8⁺T细胞则无此效应，胆汁酸与丁酸也无法直接调控CD8⁺T细胞功能。CD8⁺T细胞耗竭后，AF6敲除的抑瘤效应被逆转，证实CD8⁺T细胞是CXCL14-DC轴介导抗肿瘤免疫的关键效应细胞；过表达CXCL14可增加肿瘤内DC细胞浸润与CD8⁺T细胞的细胞毒性，敲除CXCL14则会抑制CD8⁺T细胞功能。临床样本分析显示，人肝癌组织中AF6表达显著高于癌旁正常组织，且AF6高表达与不良预后相关，肝癌组织中丁酸水平低于正常肝组织并与AF6表达负相关，肝癌患者血清与肿瘤组织中CXCL14水平显著降低，且AF6与CXCL14表达呈负相关，高CXCL14表达及低AF6/CXCL14比值与患者良好预后相关，证实AF6-胆汁酸-丁酸-CXCL14轴在人肝癌中高度保守，具有重要的临床预后与治疗意义。

图5 胆汁酸代谢改变通过树突状细胞增强肿瘤微环境中 CD8⁺T 细胞的细胞毒性

参考文献：
1. Xu K, Dong X, Qu H, et al (2026) AF6 knockout-induced upregulation of bile acid production promotes CXCL14-mediated antitumor immunity in HCC. J Hepatol S0168-8278(26)00016–4. https://doi.org/10.1016/j.jhep.2025.12.029