本文来源于微信公众：Bloki 作者：Bloki

周末愉快，分享一篇病毒载体in vivo CAR-T的Nature主刊，具体内容如下：

病毒载体in vivo CAR-T一大问题在于CAR序列随机整合进基因组带来的风险，作者计划用双病毒载体策略：EDV递送切开T细胞TRAC位点的RNP（CRISPR Cas9+sgRNA），AAV递送含CAR基因的同源介导修复HDR模版，EDV+AAV实现把CAR基因定点整合到TRAC的目的（HDR介导定点整合的文章非病毒定点整合制备CAR-T、T细胞靶向AAV的文章筛选用于T细胞基因编辑的AAV我们都整理分享过）

递送RNP（CRISPR Cas9+sgRNA）的EDV可以“干掉”TCR

EDV+AAV干掉TCR，介导CAR表达（右下象限）

DNA-PK抑制剂M3814（可抑制DNA修复中的非同源末端连接NHEJ，NHEJ会干扰同源介导修复HDR）促进EDV+AAV干掉TCR、介导CAR表达

NSG小鼠注射人PBMC构建人源化小鼠，体内，EDV+AAV介导靶向CD19的CAR表达，干掉B细胞

当人源化小鼠MHC缺陷，EDV+AAV介导靶向CD19的CAR表达、干掉B细胞的作用受限，暗示载体表达依赖小鼠MHC对T细胞的调动作用

优化AAV：AAV+人T细胞+人血清（血清内含中和AAV的抗体）共培养后，测序T细胞，筛选挖掘可抵抗中和的AAV，筛到了AAV-hT7

人血清HS影响AAV6递送效率，但筛到的AAV-hT7可抵抗人血清中的中和抗体（SF无血清）

筛AAV货物表达依赖T细胞上什么蛋白

递送GFP，筛到的AAV-hT7介导T细胞表达除了依赖AAVR、SLC35B2外，还依赖CD7（分享过CD7文章CD7靶向LNP体内高效制备CAR-T）

优化EDV：突变VSVG，使其不与LDLR互作，加CD3靶向；新的EDV搭配AAV选择性介导T细胞表达货物GFP（其他细胞表达低）

新的EDV可介导T细胞激活

优化出的EDV+AAV体外干掉TCR、介导CAR表达

体内验证病毒载体组合，anti-CD3 EDV+AAV-hT7在人源化小鼠体内不依赖MHC的高效干掉TCR、介导CAR表达

anti-CD3 EDV+AAV-hT7在人源化小鼠体内高效干掉B细胞

CAR表达影响T细胞表型（EGFRt+指示CAR表达）

anti-CD3 EDV+AAV-hT7递送CAR，抑瘤（1XX CAR-T的文章【CNS文献分享】只有1个ITAM的CD3ζ信号段对CAR-T更好我们分享过）

作者的AAV/EDV双载体in vivo CAR-T疗效优于传统的ex vivo CAR-T（LVV指示随机整合，TRAC指示定点整合）

作者的AAV/EDV双载体in vivo CAR-T增殖更优

定点整合利好CAR表达（TRAC指示定点整合）

两个靶点不同的肿瘤模型上，AAV/EDV双载体in vivo CAR-T抑瘤
帅气的病毒in vivo CAR-T玩法，定点整合好。