近十年，肿瘤微环境作为肿瘤研究领域的分支之一，在很多方面取得了进展，其重要原因在于肿瘤样本组织具有与生物复杂性相关的显著空间异质性。而肿瘤微环境研究可以揭示其中奥秘。

多重免疫荧光染色作为肿瘤微环境研究的重要手段之一，可以同时显示多种生物标志物，实现识别细胞类型，以及研究信号通路和绘制肿瘤微环境中复杂的细胞互作图谱。

尽管近年出现几种新技术，但在生物标志物发现和诊断领域工作的研究人员和临床医生仍然面临技术瓶颈：
1）组织微阵列技术的使用受到肿瘤异质性限制，
2）新型多维度空间生物学技术成本高昂。

在此背景下，Innopsys公司开发了 InnoQuant激光共聚焦荧光扫描仪，其具有经过优化的独特光学设计，可提供高质量免疫荧光染色图片，有助于高内涵数据的生成和分析。

实际案例：
NSCLC多重组织成像的案例研究
实验目的：研究非小细胞肺癌(NSCLC)中癌症组织中的免疫浸润
非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有肺癌的85%。目前，使用靶向肿瘤特定分子特征的治疗药物已成为标准方案。因此，研究肿瘤组织样本，以此来表征免疫细胞和免疫检查点有助于个体化的靶向治疗。

实验方法：
1. 利用多重免疫组织化学(mIHC)在单一组织切片上同时染色多种免疫标志物
1) PD-L1是一种免疫检查点标志物，在髓系细胞和肿瘤细胞中表达，并作为癌症免疫治疗的潜在靶点，本实验中作为肿瘤细胞标志物。
2) 颗粒酶B (Granzyme B，GrB)是一种丝氨酸蛋白酶颗粒酶，主要存在于自然杀伤细胞(NK细胞)和细胞毒性T细胞的颗粒中，本实验中作为NK细胞标志物。
3) CD8存在于T细胞中，本实验中作为细胞毒性T细胞标志物。
4) 使用Cell Signaling 公司mIHC荧光抗体进行非小细胞肺癌样本染色，具体如下: FITC标记PD-L1，AF594标记CD8，Cy5标记GrB。

2. 利用InnoQuant激光共聚焦荧光扫描仪扫描组织切片
1) 利用GrB标记物鉴定NK细胞：采用640nm激发波长产生Cy5信号，通过680/42 BP滤波器采集其发射信号。
2) 利用CD8标记物鉴定T细胞：采用561nm激发波长产生AF594信号，通过593/40 BP滤波器采集其发射信号。

3. QuPath软件分析
利用QuPath的深度学习功能，分别识别NK细胞和CD8+ T细胞。采用Delauney聚类特征2D法鉴定NK细胞簇和CD8+ T细胞簇。分析3个相邻NK或CD8+ T细胞所包围的三角形面积与 肿瘤区域边界到NK或CD8+ T细胞中心距离之间的关系。
 
实验结果:
1. 样本扫描总体情况：
冷冻切片厚度:5µm。冷冻切片总面积:97 mm²。4个荧光通道扫描时间:10分钟。ROI面积:2 mm²（图1）。  
2．自然杀伤(NK)细胞簇分析
图2中黄色标记区域为肿瘤细胞区域，蓝色标记NK细胞分布在肿瘤细胞区域内部和外部。图中大部分NK细胞集中在肿瘤细胞区域周围，部分NK细胞在肿瘤细胞区域内。 三个NK细胞间面积（µm²）被定义为由三个相邻NK细胞围成的三角形面积。最近肿瘤区域边界距离（µm）表示NK细胞质心到最近肿瘤细胞区域边界的距离。如距离为正，则NK细胞位于肿瘤细胞区域外部，如距离为负，则NK细胞位于肿瘤细胞区域内部。
 
对距肿瘤细胞区域不同距离的相邻三个NK细胞间面积的分析表明，绝大部分相邻NK细胞形成的三角形面积都在600μm2以下，且与肿瘤细胞区域边界的距离都在±12μm的范围内。面积越小，证明NK细胞密度越高，而且都集中分布在肿瘤区域周围。正如图2中所看到的，NK细胞的分布受到肿瘤细胞区域的影响，绝大部分NK细胞都围绕着肿瘤细胞区域（图3）。  
3．CD8+ T细胞簇分析
图4中黄色标记区域为肿瘤细胞区域，品红色标记CD8+ T细胞分布在肿瘤细胞区域内部和外部。图中大部分CD8+ T细胞集中在肿瘤细胞区域周围，部分CD8+ T细胞在肿瘤细胞区域内。  
三个CD8+ T细胞间面积（µm²）被定义为由相邻三个CD8+ T细胞围成的三角形面积。最近肿瘤区域边界距离（µm）表示CD8+ T细胞质心到最近肿瘤细胞区域边界的距离。如距离为正，则CD8+ T细胞位于肿瘤细胞区域外部。如距离为负，则CD8+ T细胞位于肿瘤细胞区域内部。
 
对距肿瘤细胞区域不同距离的相邻三个 CD8+ T 细胞间面积的分析表明，绝大部分相邻CD8+ T细胞形成的三角形面积都在600μm2以下，且与肿瘤细胞区域边界的距离都在±12μm的范围内。面积越小，证明CD8+ T细胞密度越高，而且都集中分布在肿瘤区域周围。说明正如图4中所看到的，CD8+ T细胞的分布受到肿瘤细胞区域的影响，绝大部分CD8+ T细胞都围绕着肿瘤细胞区域（图5）。  
实验结论：
无论是NK细胞还是CD8+ T细胞，都受到肿瘤区域的影响，集中分布在肿瘤细胞区域内外，不断浸润肿瘤组织。

利用全组织扫描成像并结合深度学习算法，可以识别不同免疫细胞以及分析其与肿瘤区域的距离。本案例证明了InnoQuant提供的整张扫描图像可以在第三方分析软件中生成相关数据。图像质量高，可以得到如细胞计数和邻近分析等统计学分析，以更好地了解患者的特定病理生理状况。这些空间和定量的数据可用于进一步预测免疫肿瘤领域的治疗反应。
 
Innopsys 成立于1999年。总部位于法国，致力于生物医学领域相关仪器和软件的自主研发和生产。
InnoQuant激光共聚焦荧光组织切片&生物芯片扫描仪：
 
* 实时激光共聚焦光路，4套独立的激光光源和PMT检测器，成像质量高；
* 多激光光路同时扫描，扫描速度快；
* 线扫描方式，图片无拼痕、无需阴影矫正，并有效降低荧光的光漂白现象及信号损失，实现精准定量；
* 组织切片的扫描和定量分析，用于神经生物学、肿瘤微环境、单细胞蛋白组学等领域；
* 微阵列芯片（基因／核酸／糖／蛋白／化合物芯片）、 单细胞WB免疫印迹芯片、覆膜芯片、细胞组织芯片及商品化芯片的扫描和分析，用于蛋白互作分析、细胞信号转导通路研究、疾病标志物筛选、化合物药物筛选、多重因子检测，病理组织标志物筛查等研究 。  
环亚生物科技（APG BIO）作为法国Innopsys公司中国区代理，为客户提供生物芯片扫描、点样以及高通量筛选的整体解决方案和服务。