在病理制片的整个流程中，固定是最关键的一步，也是最无法补救的一步。一旦组织自溶或腐败，任何后续操作都无法逆转。

所谓固定，就是组织离体后，通过各种方法使其细胞内的物质尽可能接近生活状态时的形态结构和位置。

固定的核心目的是防止组织、细胞自溶与腐败，抑制细胞内酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各种成分——蛋白质、脂肪、碳水化合物、酶类等——转变为不溶性物质，以保持原有的结构与生活时相仿。

此外，固定还能使组织硬化，增加韧性，为后续的取材和脱水创造良好条件。

固定的八大注意事项

一、固定必须及时
组织离体后，必须在1小时内立即固定。时间延误，自溶开始，不可逆转。

二、固定液的选择
应根据制作要求选择合适的固定液。最常用的是4%甲醛液或4%中性缓冲甲醛液。

三、固定液的量
固定液体积必须大于组织体积的4至10倍。量不足，固定不。

四、固定液的浓度
浓度必须准确。过稀或过浓都会影响组织形态和固定效果。

五、固定液的质量
发现固定液变质——如甲醛液体产生白色沉淀——应立即更换，不可将就。

六、固定的温度
室温或35-37℃的全封闭组织处理机内均可。温度过高会加速组织自溶和过度收缩，并破坏细胞内抗原和DNA。

七、固定的时间
新鲜标本应剖开固定12-24小时后再取材。取材后，大标本需再固定4-6小时，小标本需再固定3-4小时。

新鲜小标本取材后，应再固定4-8小时。室温低时，固定时间需延长。总固定时间不宜超过48小时。

八、分子病理的特殊要求
需要做分子病理的标本，从离体至脱水开始，总固定时间一般控制在6至24小时之间（组织厚度2mm）。

少于6小时固定不充分，超过24小时可能影响检测结果。

最常用的固定液

4%甲醛液（10%福尔马林液）

甲醛是一种无色易溶的刺激性气体。市售甲醛水溶液实际浓度为40%，易挥发，日久会自行分解产生白色沉淀（副醛：多聚甲醛或三聚甲醛），并有甲酸生成，影响组织固定和细胞核染色。长期保存应加入碳酸镁、碳酸钙等碳酸盐中和。

病理标本固定常用的4%甲醛水溶液（9份水加1份浓甲醛液，实际含甲醛4%，俗称10%福尔马林液），通过使蛋白质分子发生交联而产生固定作用。

其组织穿透性好，组织收缩小，HE染色对比鲜明，能完好保存组织形态。但交联和共价键的形成改变了蛋白质的三维结构并覆盖抗原决定簇，会降低组织抗原性。

因此，目前国际上都提倡使用10%中性缓冲福尔马林液。

4%甲醛液的优点：渗透能力较强，固定均匀；组织收缩小；能保存脂肪和类脂体（适用于冰冻切片）；增加组织韧性；有利于嗜银染色；可固定高尔基体和线粒体。

4%甲醛液的缺点：不能沉淀核蛋白和白蛋白；溶解组织内尿酸盐结晶；经甲醛固定的陈旧组织容易产生色素沉淀（可用碱性乙醇去除：浓氨水1ml加入75%乙醇200ml，切片脱蜡后浸入30分钟；或1%氢氧化钾1ml加入80%乙醇100ml，切片脱蜡后浸入10分钟。如未去除干净可延长时间，处理后流水冲洗5分钟，常规染色）。

4%中性缓冲甲醛液（10%中性缓冲福尔马林液）

这种固定液能完好保存组织形态，使蛋白质、核酸等大分子在细胞内原位凝固沉淀，防止崩解和弥漫流失，对大多数抗原和肿瘤基因保存较好，是免疫组织化学和分子病理最常用的固定液。固定时间以24-36小时为宜。

配方：甲醛100ml，蒸馏水900ml，磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·H₂O）4g，磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）6.5g，用1N NaOH调整pH至7.0。由于国内甲醛质量不稳定，实际应用中取甲醛120ml，蒸馏水880ml，磷酸二氢钠4g，磷酸氢二钠13g，效果更好。

关于固定液的选择：10%福尔马林液是最常用的病理标本固定液。随着免疫组化和分子病理的普及，提倡使用10%中性缓冲福尔马林液，以更好地保存抗原及肿瘤基因。

对比实验显示，虽然多数抗原保存差异不明显，但对少数组织的抗原和FISH癌基因检测（如Her-2）影响较为明显。固定时间结束后，如遇周末休息，应将组织长时间停留在75%乙醇或95%酒精中。

关于细胞核染色：HE染色细胞核的等电点pH为3.3-3.6。经10%中性缓冲福尔马林液固定后，在一定程度上改变了细胞核的pH值，影响细胞核与苏木精染料的结合，特别是固定不充分时，细胞核容易发灰。

关于固定与脱水的关系：固定不佳的组织，由于脱水剂（乙醇）能使蛋白质发生凝固，导致脱水剂难以渗入组织内部，造成脱水不佳；同时乙醇又起到凝固性固定的作用，使交联与凝固性固定混合，对抗原保存产生不良影响。固定充分的组织，由于固定液已全部渗透到组织内部并与组织结合，脱水剂很容易将固定液和水分置换出来，脱水顺畅。固定不足对抗原的影响，远远超过固定过度造成的影响。

关于固定时间、浓度与渗透速度：手术切除的器官及肿瘤标本，由于具有一定的立体外形和包膜，固定液浓度过高会引起周围组织收缩，影响液体渗透至深处，造成中央固定不佳；浓度过低则容易造成边缘水肿、中央固定不佳。大标本如脾、肾、全胃、肠等脏器，10%福尔马林液24小时只能穿透2-3mm的实体组织和5mm的多孔疏松组织（渗透速度受标本致密度、包膜厚度、脂肪包裹、固定液量、温度等因素影响）。取材后的组织，两面被刀切过，固定液容易渗透。如标本厚度超过5mm，经24小时固定后，通常只有边缘1-2mm的组织固定好，中央部分固定不佳甚至腐烂。因此，大标本应剖开固定，厚度以3-5mm为佳。

取材后的标本，脱水前还应再固定6-8小时。

在一定范围内，固定液浓度越高，所需固定时间越短（但浓度过高会使组织发硬、细胞收缩明显）；浓度越低，所需时间越长（浓度过低会导致组织水肿，甚至变质）。因此，选择合适的固定液浓度，不仅能快速固定组织，还能保存优良的细胞形态、结构和抗原。

关于固定速度与温度的关系：固定液温度越高，固定速度越快，所需时间越短，但细胞收缩也越明显，抗原丢失越多，过高的温度还会加速组织腐烂（固定液尚未渗透到的部分因温度升高而变质）。温度越低，固定速度越慢，过慢同样会使未渗透到的组织变性。因此，选择合适的组织厚度和固定温度非常重要。大标本应剖开后在室温下固定，取材后的标本可选择室温18-25℃固定。室温下降时，应适当延长固定时间，在37-45℃恒温箱或全自动恒温密封式脱水机内固定。

乙醇（CH₃CH₂OH）：易燃、易挥发，还原剂，能被氧化成乙醛，不能与铬酸、重铬酸钾等氧化剂配成固定液。优点是有固定、硬化和脱水作用，保存糖原可用100%乙醇固定，保存浆膜抗原优于10%中性福尔马林。缺点是渗透力较弱，易造成表面发硬；能沉淀核蛋白但沉淀物溶于水，导致核着色不良；可溶解血红蛋白，损害多种色素；固定速度较慢；对某些抗原有损伤，对核抗原保存不利；易引起组织细胞收缩。95%乙醇常用于细胞涂片固定，组织标本固定一般不采用，只有在无福尔马林时临时使用，待送达有福尔马林的科室后应立即更换。目前许多环保固定液均为醇性固定液。

乙酸（冰醋酸）：在气温16.6℃以下会结成冰状固体，故称冰醋酸。乙酸能沉淀核蛋白，使未分裂细胞核的染色质沉淀成块状，可清晰显示细胞核结构。渗透性强、固定快，能使组织膨胀，与其他液体配合使用，如甲醛乙酸液（10ml甲醛，5ml乙酸，85ml水）对HE切片固定效果好，细胞结构清晰，染色对比鲜明。但乙酸不能沉淀白蛋白，也不能固定脂肪、糖和类脂。

苦味酸（2,4,6-三硝基苯酚）：黄色晶体，常制成饱和溶液贮藏。能沉淀蛋白质，具有软化组织和脱钙作用，常与其他液体配合使用，如Bouin液（饱和苦味酸水溶液75ml，甲醛20ml，乙酸5ml）。Bouin液是骨髓、睾丸等组织固定的良好固定液，适用于结缔组织染色，尤其是三色染色。由于pH约1.7，对抗原有损害，不适宜长期保存，固定时间12-24小时。经苦味酸或Bouin液固定的组织必须流水冲洗4小时以上。

B-5固定液（乙酸钠--甲醛固定液）：渗透力较强，多用于固定淋巴组织。配方：无水乙酸钠1.25g，6g，甲醛10ml（用时加入），蒸馏水90ml。不加甲醛即为B-4固定液。用含汞成分固定的组织，染色前必须先用0.5%碘酒（70%乙醇加入碘）脱汞处理。

重铬酸钾（K₂Cr₂O₇）：橙红色板状结晶，有毒性。常用1%-3%水溶液作固定，穿透力极强，组织收缩小；可使蛋白质变为不溶性但不能使其沉淀（加入乙酸后可使蛋白质沉淀）；对线粒体、高尔基氏体固定效果较好。缺点是可溶解染色质。经重铬酸钾固定的组织必须流水冲洗12小时以上。

戊二醛（C₅H₈O₂）：无色透明油状液体，有刺激性气味。对糖蛋白、糖原、微管、内质网和细胞基质等固定作用较好，穿透力强于，能保存某些酶活力，长时间固定不会使组织变脆。但不能保存脂肪，对细胞膜显示较差，也无电子染色作用。常用2.5%水溶液作电镜组织处理的前固定，固定时间2小时以上。

（OsO₄）：白色或淡黄色晶体，剧毒，强氧化剂。对蛋白质、脂肪、脂蛋白固定良好，有较强的电子染色作用，图像反差好。常用1%水溶液作电镜组织处理的后固定，固定时间视温度而定：室温高于18-20℃时1小时，低于18-20℃时1.5-2小时。缺点：固定时间过长易使组织发脆，不易切片；需临用前几天配制以确保充分溶解。

Carnoy液：对染色体固定较好，能很好显示DNA和RNA。固定速度快，3mm厚组织块固定1小时左右，较厚组织不超过4小时。配方：乙酸10ml，30ml，无水乙醇60ml。

Helly液（Zenker福尔马林液）：对细胞质固定较好，特别是细胞质内特殊颗粒、胰岛以及心肌闰盘保存效果良好。因含汞成分，染色前需用0.5%碘酒脱汞处理。配方：重铬酸钾2.5g，5g，蒸馏水100ml，甲醛5ml。

Kanovsky液：对细胞抗原、微细结构的保存优于单纯戊二醛，常用于免疫电镜标本的前固定。先灌注、再浸泡，固定时间10-30分钟，缓冲液漂洗后用蔗糖液浸泡，恒温冷冻切片。配方：25%戊二醛10ml，40%甲醛5ml，0.2mol/L二甲胂酸钠缓冲液49ml，无水氯化钙50mg，蒸馏水33.5ml（加入），pH7.3。

Rossman液：常用于糖原固定。组织固定12-24小时后，用95%乙醇洗，无水乙醇脱水。配方：无水乙醇苦味酸饱和液90ml，甲醛10ml。

Zenker液：对免疫球蛋白、病毒包涵体（如Negri小体）固定效果较好，细胞核和细胞质染色清晰，常用于三色、磷钨酸-苏木精等特殊染色。不适合含血量较多的标本。固定时间12-36小时，加热可加快固定。配方：储存液由重铬酸钾2.5g，5g，蒸馏水100ml组成，用时加入乙酸5ml。配制时加温至40-50℃溶解，冷却后过滤，保存于棕色玻璃磨砂瓶内。此液不能用金属容器盛放，组织固定后也不能用金属镊子夹取。用Zenker液固定的组织必须流水冲洗12小时去除重铬酸钾，脱水前用0.5%碘酒脱汞处理。

4%多聚甲醛液：常用于免疫组织化学组织固定。配方：4g多聚甲醛溶于100ml蒸馏水，加温至60℃搅拌溶解。多聚甲醛不易溶解，也可将液体放入密封瓶中，60℃温箱过夜溶解。

固定，是整个制片流程中无法回头的一步。这一步做扎实了，后续的脱水、切片、染色才有意义。这一步马虎了，后面再怎么补救，都很难得到一张真正合格的切片。