2026年4月2日，西湖大学医学院董晨院士团队在 Nature Immunology 在线发表了题为“A unique CD4⁺ T cell subset expressing granzyme K is regulated by transcription factor EOMES and important for T cell-mediated intestinal inflammation”的研究成果。该研究鉴定出一种以高表达颗粒酶K（GZMK）为特征的新型CD4⁺ 辅助T细胞亚群——T_HK细胞，并系统揭示了其由转录因子EOMES调控的特异机制及其在肠道炎症中的关键作用。这一发现不仅丰富了CD4⁺ T细胞的功能分类体系，还为炎症性肠病等慢性炎症疾病的免疫治疗提供了新思路。

南模生物为该研究提供了Gzmk-2A-CreERT2-2A-tdTomato（目录号：NM-KI-241127）小鼠模型。

肠道炎症性疾病严重威胁人类健康，传统观点认为CD4⁺ T细胞可分为T_H1、T_H2、T_H17、T_reg等经典谱系，每个亚群都有专属的核心转录因子，介导不同类型的免疫应答。颗粒酶家族蛋白此前主要发现于具有杀伤功能的免疫细胞中，其中颗粒酶K（granzyme K，GZMK）在CD4⁺ T细胞中的表达缺乏系统鉴定。对此，研究团队进行了以下研究：

1 人类中具有非典型特征的 GZMK⁺ CD4⁺ T细胞
为探究肠道炎症中是否存在非经典的CD4⁺ T细胞亚群，研究团队重新分析了来自炎症性肠病（IBD）患者（包括溃疡性结肠炎和克罗恩病）及健康对照者的整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集。结果表明，除已知的T_H1、T_H2、T_H17、T_FH及T_reg等亚群外，存在一个以GZMK高表达为特征的CD4⁺ T细胞群体，该群体几乎不表达典型的CD4⁺ T细胞谱系标志物，同时GZMB表达极低（图1a）。进一步分析显示，在活动性溃疡性结肠炎患者的黏膜活检组织中，GZMK的表达水平显著高于缓解期患者和健康对照（图1b）。此外，在人类泛癌scRNA-seq数据中同样可观察到这一GZMK⁺ high CD4⁺ T细胞群体，且同样缺乏典型谱系标志物。以上数据提示，GZMK⁺ CD4⁺ T细胞是一个在人类炎症及肿瘤背景下广泛存在、具有非典型分子特征的潜在新亚群。
 

图1. 人类肠道炎症中GZMK表达CD4⁺ T细胞亚群的鉴定

2 小鼠结肠炎中表达GzMK的CD4⁺ T细胞的特性
为明确小鼠结肠炎模型中是否存在类似的GzMK⁺ CD4⁺ T细胞群体，研究团队整合了初始CD4⁺ T细胞过继转移结肠炎模型的公共scRNA-seq数据集。结果表明，结肠CD4⁺ T细胞可被分为六个转录亚群，其中聚类1以高表达Gzmk、几乎不表达其他谱系定义转录因子为特征，区别于T_H1、T_H17、T_reg等经典亚群（图2a-c）。进一步利用Gzmk-P2A-CreERT2-T2A-tdTomato（GzmK-tdTomato）报告小鼠进行验证，发现在结肠炎小鼠的结肠固有层及肠系膜淋巴结中均可检测到GzmK-tdTomato⁺ CD4⁺ T细胞，且这些细胞主要为效应/记忆表型（CD44⁺ CD62L^-）（图2d-e）。与GzmK^- tdTomato^- 细胞相比，该群体表达更高水平的穿孔素和颗粒酶B，但IFNγ表达水平相对较低（图2f-g）。体外细胞毒性实验显示，GzmK-tdTomato⁺与 GzmK-tdTomato^- CD4⁺ T细胞对靶细胞均具有相似的杀伤能力。以上数据表明，小鼠结肠炎中存在一个独特的GzmK⁺ CD4⁺ T细胞亚群（T_HK），其具有效应/记忆表型，但细胞毒活性并非该群体所特有。

图2. 小鼠结肠炎中一个独特的Gzmk表达CD4⁺ T细胞群体

3 T_HK细胞分化不依赖于经典辅助T细胞谱系
为明确T_HK细胞的分化是否需要已知的辅助T细胞发育通路，研究团队采用共转移体系，将野生型与Tbx21缺陷（T_H1 谱系关键转录因子缺失）的初始CD4⁺ T细胞同时转入Rag1^-/-受体小鼠。结果显示，尽管Tbx21缺陷导致GZMB表达显著降低，但穿孔素阳性的CD4⁺ T细胞频率反而增加，且Gzmk的表达水平未受明显影响（图3a-c）。进一步分析显示，在Stat6缺陷（T_H2谱系必需）的CD4⁺ T细胞中，Gzmk与穿孔素的表达基本不变（图3d-e）；而在Rorc缺陷（T_H17谱系相关）的CD4⁺ T细胞中，两者的表达反而显著升高（图3f-g）。此外，Bcl6缺陷可降低结肠CD4⁺ T细胞中Gzmk与Prf1的表达。同时，T_HK细胞不表达CD8α，且Runx3缺陷对Gzmk表达无显著影响。以上数据表明，T_HK细胞的分化独立于T_H1、T_H2和T_H17的经典谱系定向程序，可能来源于Bcl6⁺ 祖细胞群体，且不同于CD4⁺ CD8α⁺ 细胞毒性T细胞。
 

图3. T_HK细胞分化不依赖于T_H1、T_H2和T_H17程序

4 Eomes与T_HK细胞在转录和表观遗传上相关联
为探究调控T_HK细胞独特身份的关键转录因子，研究团队对结肠炎小鼠固有层中分选的GzmK-tdTomato⁺与GzmK-tdTomato^- CD4⁺ T细胞进行了bulk RNA-seq分析。结果表明，GzmK⁺ 细胞具有独特的转录特征，其中Eomes 是上调最显著的基因之一（图4a）。将该T_HK特征基因集映射至scRNA-seq数据，发现聚类1（T_HK）富集评分最高（图4b）。进一步分析显示，在小鼠结肠炎及人类CD4⁺ T细胞数据中，Gzmk与Eomes 呈现近乎一致的共表达模式（图4c-d）；在溃疡性结肠炎患者的bulk RNA-seq数据中，EOMES与GZMK的表达呈最强正相关（图4e）。流式细胞术也证实，结肠炎小鼠的固有层及肠系膜淋巴结中，GzmK-tdTomato⁺ 细胞与EOMES蛋白显著共表达（图4f）。时间进程分析显示，T_HK细胞在转移后第14天出现，约3-4周达稳定水平，晚于T_H1和T_H17细胞。此外，EOMES的表达不依赖于T-bet、STAT6或RORγt，但受Bcl6调控（图4g-j）。ATAC-seq分析显示，GzmK⁺ 细胞在Eomes、Gzmk、Prf1等T_HK相关基因座具有更高的染色质可及性，而典型CD4⁺ 谱系基因（如 Rorc、Il17a）则相反（图4k-l）。基序富集分析表明，T-box家族基序（包括Eomes结合位点）在GzmK⁺ 细胞的可及性区域中显著富集（图4m）。以上数据表明，Eomes与T_HK细胞在转录和表观遗传水平上紧密相关，是调控该亚群身份的关键候选因子。
 

图4. Eomes在转录水平和表观遗传学层面均与T_HK细胞身份相关

5 EOMES驱动T_HK命运并限制替代性辅助T细胞谱系
为明确EOMES是否足以诱导T_HK细胞转录程序，研究团队在非极化条件下活化CD4⁺ T细胞并逆转录病毒过表达Eomes，随后进行bulk RNA-seq分析。结果显示，与对照相比，Eomes过表达导致1,239个基因上调和1,336个基因下调（图5a）。基因富集分析证实，T_HK细胞特征在Eomes过表达细胞中显著富集（图5b）；将该上调特征映射至结肠炎CD4⁺ T细胞scRNA-seq数据，发现其在聚类1（T_HK）中富集程度最高（图5c）。流式细胞术进一步表明，Eomes过表达在非极化条件下显著增加了GzmK-tdTomato及穿孔素的表达（图5d-e）。CUT&Tag实验显示，EOMES直接结合Gzmk和Prf1基因座，且这些区域在T_HK细胞中染色质可及性增加（图5f-g）。此外，在体外T_H1、T_H2、T_H17及T_reg极化条件下，Eomes过表达分别抑制了T-bet、GATA3、RORγt/IL-17A及FOXP3的表达；在OVA免疫模型中，Eomes过表达也抑制了TFH细胞标志物PD-1、CXCR5和BCL6。结肠炎小鼠中，T_HK细胞几乎不表达BLIMP1。以上数据表明，EOMES不仅直接驱动T_HK核心程序，同时抑制其他辅助T细胞谱系的分化。

图5. Eomes在转录水平和表观遗传学层面均与T_HK细胞身份相关

6 Eomes是结肠炎中T_HK细胞分化所必需的
为确定Eomes是否为T_HK细胞体内发育所必需，研究团队将Cd4-Cre；Eomes^fl/fl（Eomes-cKO）初始CD4⁺ T细胞与野生型对照共转移至Rag1^-/- 受体。结果显示，Eomes-cKO细胞中T_HK相关基因（Gzmk、Prf1、Nkg7、Slamf7）表达显著降低，T_HK 特征富集评分下降（图6a-c）。整合多组学数据，共鉴定出18个EOMES直接靶基因，包括Gzmk、Prf1、Ccl5等（图6d-e）。功能上，Eomes-cKO组小鼠结肠炎显著减轻，表现为体重下降减少、结肠缩短缓解及组织学评分降低（图 6f-h）。流式细胞术显示，Eomes缺陷几乎完全消除 GzmK-tdTomato 表达，并显著降低穿孔素水平，但GZMB、T-bet及IFNγ变化有限（图6j-l）。同时，RORγt⁺ 、IL-17A⁺ 及 FOXP3⁺ 细胞频率升高，提示缺乏T_HK时细胞向替代谱系偏移。相比之下，单独缺失Gzmk并不减轻疾病。以上数据表明，Eomes是T_HK细胞分化所必需的关键转录因子，其调控的效应程序具有冗余性，靶向EOMES核心网络可能更具治疗潜力。
 

图6. Eomes是T_HK细胞分化及肠道免疫病理学过程所必需的因子

7 Eomes依赖的T_HK程序驱动肠道炎症
为评估T_HK细胞在肠道炎症中的致病作用，研究团队将Eomes-cKO或对照小鼠的初始CD4⁺ T细胞分别转移至Rag1^-/-受体。结果显示，Eomes-cKO组小鼠结肠炎显著减轻，表现为体重下降减少、结肠缩短缓解及组织学炎症评分降低（图6f-h）。两组供体T细胞总数无显著差异，排除增殖或归巢缺陷（图6i）。流式细胞术表明，Eomes缺陷几乎完全消除GzmK-tdTomato表达，并显著降低穿孔素水平，但GZMB、T-bet 及 IFNγ 仅轻度改变（图6j-l）。值得注意的是，Eomes缺陷导致RORγt⁺ 、IL-17A⁺及FOXP3⁺ CD4⁺ T细胞频率升高，提示T_HK缺失促使细胞向替代谱系偏移。相比之下，单独缺失Gzmk并不减轻疾病。以上数据表明，Eomes依赖的T_HK程序是驱动肠道炎症的关键，其致病效应依赖于EOMES下游多个效应分子的协同作用，而非单个GZMK。

总的来说，本研究通过单细胞转录组、多组学分析、基因敲除与过表达、结肠炎模型等多种实验技术方法，发现并系统鉴定了以高表达Gzmk为特征、受转录因子EOMES驱动的CD4⁺ T细胞新亚群——T_HK细胞。该细胞独立于经典T_H分化通路，且转录程序在人类和小鼠的多种疾病中高度保守。它指明了EOMES-T_HK细胞作用轴是一个潜在的、富有前景的治疗靶点。针对这一通路的干预，有望为炎症性肠病等T细胞介导的慢性炎症性疾病带来新的精准治疗策略。

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