超分辨无标记化学成像新技术可清晰呈现小于200纳米的精细三维结构
2026-05-07 来源:本站 点击次数:164受激拉曼散射（SRS）显微技术作为一种强大的无标记化学成像平台，虽然能够在无需外源染料的情况下揭示细胞代谢与分子动力学，但其轴向分辨率一直受限于光学衍射极限，难以清晰呈现小于200纳米的精细三维结构。为了攻克这一长期存在的技术瓶颈，科研人员将4Pi干涉技术与SRS系统深度融合，成功开发出一种名为4Pi-SRS的超分辨无标记化学成像新技术。
该项突破性研究由Jonathan I. Kim、Zachary Ellsworth、Erin L. Dunnington等学者共同完成，文章题为《4Pi stimulated Raman scattering for label-free super-resolution chemical imaging》，于2026年1月发表在顶级学术期刊《SCIENCE ADVANCES》上。这项研究不仅将轴向分辨率提升了近七倍，还大幅增强了成像灵敏度，为生命科学和临床医学的无标记超分辨成像开辟了全新的道路。
重要发现
014Pi-SRS显微系统的创新设计与原理验证
为了实现4Pi-SRS显微系统，研究人员在传统的SRS光路中巧妙地集成了一个由两个相对放置的高数值孔径（NA）物镜构成的4Pi干涉腔。该系统使用频率分别为793纳米和1030纳米的泵浦光与斯托克斯光，并通过电光调制器以17.5兆赫兹的频率进行调制。两束光在进入干涉腔前先由二向色镜在空间上重合，随后通过光栅拉伸器将脉冲持续时间调整为约4皮秒，以确保在光谱聚焦方案下实现最优的信号激发。
在4Pi腔体中，两台50/50非偏振分束器（NBS）扮演着核心角色。它们将泵浦光和斯托克斯光均等分为上下两臂，使得光束能够从上下两个方向同时聚焦在样品的同一焦平面。为了保证两束对向传播的光能够发生完美的相长干涉，系统引入了机械延时调节和电压控制的向列相液晶进行精细的光程差校正。这种双向激发与干涉的设计，使得激发体积在轴向上产生了极强的压缩效应。仿真结果表明，传统的SRS轴向分辨率约为1000纳米，而4Pi-SRS的激发点扩散函数（PSF）在轴向产生了一系列明暗相间的干涉条纹，其中中心亮斑的轴向半高宽被锐减至约150纳米，同时保持了约300纳米的横向分辨率。
02系统灵敏度与非线性信号增强的定量表征除了提升分辨率，4Pi结构还带来了意想不到的灵敏度增益。由于SRS信号与激发光的峰值强度呈非线性关系，双光束的相干叠加使得焦点处的峰值强度增加了两倍，从而导致SRS绝对信号实现了四倍的增长。为了量化这一灵敏度提升，研究人员对苯甲腈（benzonitrile）在3070波数的拉曼跃迁进行了测试。实验结果清晰地显示，当上下两臂的光程完美匹配时，两对同向和反向传播的脉冲在时域上完全重合，三个拉曼跃迁峰合并为一个，信号强度达到了单臂激发的两倍。这种灵敏度的显著增强，意味着系统能够以更高的信噪比探测到极其微弱的生化信号。
03基于纳米级聚苯乙烯微球的分辨率评估
为了严谨地评估4Pi-SRS的实际空间分辨率，研究团队使用不同直径的聚苯乙烯（PS）微球进行了标样成像。在对80纳米的微球进行三维成像时，由于其尺寸小于系统的衍射极限，微球的像完全由系统的PSF决定。测量结果显示，80纳米微球的轴向半高宽被锐化到了155纳米，平均达到162±13纳米；而经过去卷积算法处理后，系统的实际轴向分辨率估算值更是高达142纳米，这与理论模拟高度吻合。同时，小尺寸微球的信号强度相较于传统SRS提升了约三倍，充分证明了该系统在探测微小结构时的超高灵敏度和空间分辨能力。
04哺乳动物细胞内脂滴分布的超分辨三维可视化
脂滴作为细胞内重要的能量储存和代谢调控细胞器，其微小的亚细胞结构在传统SRS下往往因轴向模糊而无法精准解析。研究人员将4Pi-SRS应用于A549非小细胞肺癌细胞中的脂滴成像。在2850波数的脂质特征峰下，4Pi-SRS不仅展现出极强的背景抑制能力，还将一个微小脂滴的轴向半高宽从传统SRS下的1289纳米压缩至160纳米。通过结合PureDenoise算法和非盲混合L0全变分去卷积处理，系统成功消除了干涉产生的旁瓣伪影，清晰分辨出细胞质中轴向距离极近的脂滴对，其定位精度达到了前所未有的水平。这为深入理解癌细胞在氧化应激和耐药过程中的脂质代谢机制提供了强有力的影像学工具。
05大肠杆菌膜结构与脂肪酸代谢产物的纳米级解析
在更微小的原核生物成像中，4Pi-SRS同样展现出了卓越的性能。大肠杆菌的外膜、肽聚糖层和内膜总厚度仅为60纳米左右，且其直径通常在500至700纳米之间，是检验成像技术分辨率的极佳样本。通过4Pi-SRS在2850波数和2930波数（蛋白质特征峰）的双色成像，研究人员成功地在短轴截面上将大肠杆菌的内外细胞膜在三维空间中分离开来，测得的单层膜结构轴向半高宽为220纳米。此外，该系统还以157纳米的轴向分辨率清晰呈现了大肠杆菌分泌出的微量脂肪酸产物。高光谱分析进一步证实，细胞膜区域表现出显著的脂质富集特征，而细胞质则呈现出高蛋白特征，完美实现了化学特异性与超高精度空间定位的结合。
创新与亮点
该论文最大的突破在于首次成功将4Pi干涉显微技术引入受激拉曼散射（SRS）成像领域，以纯粹的物理学光路干涉方式，将无标记化学成像的轴向分辨率提升了近七倍（从约1000纳米优化至142纳米），并同步实现了最高四倍的光学信号灵敏度增强。
在技术应用层面，4Pi-SRS完美克服了以往超分辨SRS技术依赖特殊光控标签、易受光毒性损伤或信号被过度稀释的致命缺陷。该技术具有极强的普适性和兼容性，能够无缝对接现有的超分辨SRS手段（如可见光激发、样品膨胀或可逆光控开关技术），从而向各向同性且低于100纳米的极限空间分辨率发起冲击。在临床病理诊断和活体组织代谢研究中，4Pi-SRS能够提供极其精准的三维超微结构信息，无需复杂的样本前处理即可洞察疾病相关的纳米级细胞器变异，为下一代无标记、无损伤、高通量的临床影像分析奠定了核心技术基础。
总结与展望
这项研究通过光学硬件的创新重构，成功打破了受激拉曼散射技术在轴向分辨率和检测灵敏度上的物理壁垒。4Pi-SRS不仅实现了对哺乳动物细胞脂滴、细菌细胞膜等微小结构的精准三维解析，更为无标记超分辨化学成像确立了一个新的行业标杆。
论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
Kim JI, Ellsworth Z, Dunnington EL, Wong BS, Mehta NR, Zensho C, Fu D. 4Pi stimulated Raman scattering for label-free super-resolution chemical imaging. Sci Adv. 2026 Jan 2;12(1):eaec0523.
DOI:10.1126/sciadv.aec0523.