本文要点：位于近红外第二窗口（NIR‑II，1000–1700 nm）的荧光探针具有高组织透过率、最小的组织光子散射与吸收特性，已被广泛应用于疾病早期诊断。本文提出一种全新的原位策略，通过对化学合成的Ag₂S纳米颗粒（NPs）进行后处理，制备超高亮度Ag₂S纳米颗粒（Ag₂S超级纳米颗粒）：仅需2分钟快速微波辐照即可生长一层保护性外壳。该外壳可有效降低表面缺陷与结构缺陷，使量子产率提升25倍，荧光寿命提升38倍。经聚乙二醇（PEG）修饰的Ag₂S超级纳米颗粒无毒性，可在低激发激光（1 mW/cm²）与低给药剂量（0.5 mg/kg）下实现体内深层组织成像。进一步偶联靶向肽后，在胃炎与心肌炎模型的靶向炎症成像中，Ag₂S超级纳米颗粒的成像性能显著优于商用Ag₂S纳米颗粒，荧光强度提升90%以上。本研究提供一种高效、低成本、快速的增强方法，可制备超高亮度NIR‑II成像造影剂，推动其在临床前诊断成像中的应用。

荧光成像无创灵敏，是疾病早期诊断的重要手段，但体内应用受组织信号衰减限制。近红外生物窗口（700–1800 nm）可提升光穿透深度，其中NIR‑II（1000–1700 nm）最具应用价值，相关荧光纳米颗粒能实现高信噪比深层成像。Ag₂S纳米颗粒为典型NIR‑II材料，发射谱宽、无毒性重金属、Ag⁺释放极少，且800 nm激发可降低背景自发荧光，适合体内使用。然而其亮度不足，量子产率与荧光寿命偏低，主要受等离子耦合、表面结构缺陷及溶剂相互作用影响。现有改性方法中，飞秒激光处理效果显著但设备昂贵、耗时久，超声处理可小幅提升量子产率，却无法解决溶剂猝灭问题，仍需更简便高效的亮度增强技术。

图1. Ag2S super NPs的合成工艺示意图（a）及其靶向修饰后对胃炎和心肌炎的体内高亮度、低剂量炎症成像的应用能力（b）。

本研究提出一种简单高效的Ag₂S纳米颗粒化学合成后处理方法，可使量子产率提升25倍（图1）。该方法仅需将分散在三氯甲烷（CHCl₃）中的Ag₂S纳米颗粒用微波炉进行2分钟超快非电离辐照，诱导形成AgCl保护性外壳，显著降低溶剂猝灭效应与表面/结构缺陷带来的非辐射跃迁。经靶向肽修饰后的超高亮度Ag₂S纳米颗粒，可在超低激发光强（30 mW/cm²）与超低注射剂量（~0.5 mg/kg）下实现胃炎、心肌炎的高质量体内成像，荧光强度较商用探针提升2倍。本工作为制备超高亮度NIR‑II发射造影剂提供快速、低成本、操作简便的策略，推动其在临床前诊断成像中的应用。

微波是一种非电离电磁能，频率范围300–300000 MHz，可凭借高能量加速化学反应。本研究采用功率可调微波炉提供微波能量，将化学合成的Ag/Ag₂S异质二聚体（以下简称Ag₂S纳米颗粒）分散于CHCl₃中，经微波辐照制备Ag₂S超级纳米颗粒。本化学合成方法会产生副产物Ag纳米颗粒，这是由于合成温度下Ag⁺氧化还原电位较高所致。

图2. 微波辐照前后Ag2S纳米粒子的形貌和元素分析。

在CHCl₃中的Ag纳米颗粒经微波辐照会转化为AgCl。图2展示微波辐照前后Ag₂S纳米颗粒的形貌与元素分析。图2a为微波辐照前Ag₂S纳米颗粒的透射电镜（TEM）图像，纳米颗粒呈椭圆形，平均尺寸约10 nm，单个颗粒内存在两种明显衬度，表明单一颗粒内形成两种不同物相。图2b高分辨扫描透射电镜（HRSTEM）与元素分析（图2c–e）显示，单个Ag₂S纳米颗粒呈类蛋黄‑壳晶体结构，核心电子致密，外壳电子透明。核心晶面间距d(111)=2.34 Å，对应立方相Ag；外壳晶面间距d(̅103)=2.38 Å，对应单斜相Ag₂S。衬度差异源于Ag₂S密度（7.2 g/cm³）低于Ag（10.50 g/cm³）。元素mapping（图2c–e）显示核心富Ag，S主要分布于外壳；EDX能谱（图2f）显示Ag:S原子比为64:36；XRD图谱（图2g）证实存在立方相Ag与单斜相Ag₂S。综上，合成的Ag₂S纳米颗粒内部含Ag核心。

经210 W微波辐照2分钟后，纳米颗粒平均直径由10 nm增至12 nm（图2h）。图2i高分辨STEM显示两种晶面：核心晶面间距d(200)=2.04 Å（立方相Ag），外壳晶面间距d(122)=2.09 Å（单斜相Ag₂S）。颗粒周围出现约1 nm厚无定形层（蓝色标注）。元素mapping（图2j–l）显示辐照后颗粒仍含Ag、S，且全部分布Cl元素（图2m），源于AgCl层形成。EDX分析（图2n）与XRD图谱（图2o）进一步证实AgCl存在，微波处理后Ag:S:Cl原子比为63:31:6。结果表明，Ag₂S纳米颗粒由立方相Ag与单斜相Ag₂S组成，经微波辐照后结构与组成改变，表面形成全新的无定形AgCl薄外壳。

图3. 微波辐照前后Ag₂S纳米粒子的荧光性质表征。

微波辐照引发的结构变化显著提升光学性能。如图3a，微波处理后样品在400–800 nm处吸光度降至30%，且与210 W下辐照时间密切相关。处理前Ag₂S纳米颗粒在400 nm附近有特征肩峰，源于小尺寸Ag₂S纳米颗粒的等离子体带，微波处理后该峰消失。

图3b为1.5 mg/mL CHCl₃分散液中微波辐照（210 W，2分钟）前后Ag₂S纳米颗粒的光学照片，颜色无明显变化；但NIR‑II荧光图像（图3c）显示，微波辐照后亮度显著提升。未处理的化学合成Ag₂S纳米颗粒几乎检测不到NIR‑II荧光信号。

图3d为210 W下不同辐照时间（1、2、4、6、8、10分钟）的Ag₂S纳米颗粒荧光光谱。辐照后发射强度较未处理组提升，2分钟时达到最大增强，随时间延长逐渐下降；光谱形状保持一致，表明微波处理未改变化学组成，但发射峰位发生微小红移（由1220 nm至1255 nm），可能源于CHCl₃解离产生活性氯，在Ag₂S纳米颗粒表面形成高氯覆盖层。

荧光量子产率（QY，图3e）与荧光寿命（图3f）随微波时间的变化趋势与发射强度一致：1分钟辐照后QY开始上升，2分钟达峰值，继续延长时间则下降。经210 W、2分钟微波处理，Ag₂S纳米颗粒QY由0.38%提升至9.8%，增幅约25倍，实现向Ag₂S超级纳米颗粒的转化；相应荧光寿命由0.37 μs延长至2.31 μs（图3f），荧光衰减曲线见图3g。该寿命增强不受Ag₂S超级纳米颗粒浓度影响，排除自吸收对寿命测量的干扰（图3h–i）。

图4. 微波辐照Ag₂S纳米粒子增强机理探讨。

为探究微波诱导Ag₂S超级纳米颗粒的亮度增强机制与最优实验条件，开展系列关键实验，所有样品浓度均标准化为1.5 mg/mL。图4a为不同功率（70、210、350、560、700 W）、不同时间（0–10分钟）辐照下Ag₂S纳米颗粒的NIR‑II发射强度。70–210 W、辐照<4分钟时，发射强度随时间上升；超过阈值后趋于稳定。210 W下2分钟即可实现14倍强度增强，继续辐照则强度下降，源于长时间高功率微波导致Ag₂S降解与热猝灭。功率>210 W时，1分钟辐照增强有限，延长时间则强度下降并趋于稳定，一方面源于高功率热猝灭，另一方面源于高功率下溶剂CHCl₃快速蒸发导致反应不完全。各组样品颜色无明显差异，最优荧光增强条件为210 W、2分钟。

探究溶剂影响：选用环己烷、二甲基亚砜（DMSO）、乙腈等常用有机溶剂，结果显示仅在CHCl₃中可实现微波诱导转化，其他溶剂中NIR‑II荧光下降，主因是微波热效应与Ag₂S本征热猝灭共同作用（图4b）。探究Ag核心作用：无Ag核心的Ag₂S纳米颗粒经微波辐照荧光无增强（图4c）。因此，CHCl₃存在与Ag纳米颗粒存在是微波诱导纳米颗粒向超级纳米颗粒转化的必要条件。

综合实验结果，提出纳米颗粒向超级纳米颗粒转化机制（图4d）：微波辐照下，Ag纳米颗粒吸收高能量发生降解，溶液中活性Ag⁺浓度快速上升；被Ag₂S包裹的Ag核心不受微波影响。Ag⁺与溶剂CHCl₃反应生成AgCl，在微波辅助下沉积于Ag₂S纳米颗粒表面。最终，窄带隙Ag₂S（0.9 eV）被宽带隙AgCl（5.13 eV）无机外壳保护性包覆。AgCl外壳一方面减少CHCl₃溶剂猝灭导致的非辐射跃迁，另一方面抑制表面/内部缺陷引发的非辐射退激发，同时显著降低Ag₂S超级纳米颗粒的光热转换效率（图4e–h），与低亮度商用Ag₂S纳米颗粒的光热对比实验也证实这一点。

图5. PEG-Ag₂S超纳米粒的体内外细胞毒性研究。

为开展体内实验，首先对Ag₂S超级纳米颗粒进行理想的亲水表面修饰。采用配体交换法将HS‑PEG‑COOH修饰于颗粒表面，使其转移至磷酸盐缓冲液（PBS）中。细胞毒性实验：在MCF‑10A、293‑T、HepG2、MCF7细胞系中，分别用10、25、50、100、200 μg/mL的PEG‑Ag₂S超级纳米颗粒孵育24小时（图5a）和48 h（图5b）。MTT结果显示，200 μg/mL高浓度下48小时内无显著细胞毒性，适合体内应用。

体内生物相容性系统评价：4周龄昆明小鼠腹腔注射PEG‑Ag₂S超级纳米颗粒PBS分散液（300 μL，0.5 mg/mL，总剂量150 μg，~6 mg/kg），连续15天监测体重、摄食量、体温；对照组注射300 μL PBS。如图5c-e所示显示两组无显著差异，实验组体重平稳增长，与对照组一致，表明注射不影响正常代谢。综上，PEG‑Ag₂S超级纳米颗粒生物相容性高、无毒性，是理想的体内成像候选材料。

图6. PEG-Ag₂S超微粒子的体内成像性能。

体内性能直接对比实验：选用商用Ag₂S纳米颗粒、钕掺杂稀土氟化物纳米颗粒（NaGdF₄:Nd）、单壁碳纳米管（SWNTs）三种常用NIR成像探针。6周龄裸鼠分为四组，皮下注射100 μL 1.5 mg/mL各探针PBS溶液，剂量5 mg/kg。如图6a所示，在功率密度为1 mW/cm2至30 mW/cm2的808 nm激光照射下，为每组捕获活体NIR-II荧光图像。在相同的实验条件下，Ag2S超纳米粒的亮度明显高于其他近红外探针。根据之前的研究，在NIR-II成像观察期间，所有荧光探针的可见NIR发射性能差异可完全归因于亮度变化。因此，即使在1 mW/cm2的极低激光辐照功率密度下，Ag2S超级NPs的优异亮度也能够获得NIR信号，其中没有从任何其他选定的NIR探针检测到荧光信号。图6b量化了不同NIR探针的信噪比（SNR）值，显示了功率密度依赖性，这在静脉注射30 min后在不同功率密度下获得的NIR-II图像中进一步说明（图6e-f）。此外，图6a表明，合成的Ag2S超级NPs将最小励磁功率密度降低了30倍以上。

静脉注射（100 μL，0.15 mg/mL，总剂量15 μg~0.5 mg/kg）监测体内生物分布，该剂量远低于已有报道的6.6 mg/kg。在808 nm、30 mW/cm²激光下采集图像，该功率远低于国际非电离辐射防护委员会安全阈值（329 mW/cm²）。注射后3分钟，部分PEG‑Ag₂S超级纳米颗粒开始在肝脏聚集，荧光信号覆盖小范围区域；30分钟后，大部分颗粒被肝脏网状内皮系统捕获；100分钟后离体器官成像（图6d）与定量结果证实这一分布。肝脏在100分钟时荧光强度较30分钟下降约10%，源于Kupffer细胞与肝窦内皮细胞的部分清除作用。

研究表明，炎症急性期最主要的细胞是表达炎症趋化因子CXC配体9（CXCL9）的巨噬细胞。为实现精准靶向炎症成像，将特异性结合CXCL9的肽配体通过脱水缩合偶联于PEG‑Ag₂S超级纳米颗粒与商用PEG‑Ag₂S纳米颗粒表面，赋予探针炎症组织靶向能力。

图7. LPS诱导巨噬细胞CXCL9的体外水平及Ag2S超核蛋白体外靶向结合的评价。

体外验证LPS诱导巨噬细胞中CXCL9表达：图7a免疫荧光图像显示，LPS处理的RAW 264.7小鼠巨噬细胞与抗CXCL9抗体孵育后呈现强红色荧光，细胞核蓝色、细胞骨架绿色；未处理组无明显红色荧光。统计分析显示两组CXCL9表达差异显著；蛋白质印迹（WB）结果一致（图7b和f）。图7d显示了细胞摄取的示意图。因共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）无法检测NIR‑II信号，采用Cy5标记的靶向探针（Cy5‑T‑Ag₂S超级纳米颗粒，CTNPs）与非靶向探针（Cy5‑PEG‑Ag₂S超级纳米颗粒，CNPs）。将CNPs和CTNPs与LPS诱导的巨噬细胞共孵育，观察CNPs和CTNPs的细胞内化行为。CTNPs组的CLSM图像显示明显的红色荧光。然而，在CNPs组中，仅观察到极小的细胞内红色荧光（图7c）。此外，当LPS诱导的巨噬细胞用CXCL9抗体预处理时，细胞内的红色荧光强度显著减弱（图7g）。这些发现强调了CXCL9靶向在促进纳米探针与炎症细胞有效结合中的关键作用。因此，这表明T-Ag₂S超级NPs比PEG-Ag₂S超级NPs更容易被巨噬细胞吞噬，这可能是由于CXCL9介导的相互作用增强所致。这些结果为炎性靶向T-Ag₂S超纳米粒在体内炎症显像中的应用提供了坚实的实验基础。

图8. 小鼠体内胃炎模型构建和成像。

胃炎模型构建：腹腔注射20 mg/mL LPS溶液（总剂量50 mg/kg），连续监测生理状态5小时，模型构建成功。组织病理学与血液分析证实胃黏膜结构损伤、炎症细胞浸润，炎症标志物（TNF‑α、IL‑6、PGE₂、CRP、MDA）显著升高。小鼠随机分为四组：（1）胃炎+T‑Ag₂S超级纳米颗粒；（2）胃炎+T‑商用Ag₂S纳米颗粒；（3）胃炎+PEG‑Ag₂S超级纳米颗粒；（4）健康+T‑Ag₂S超级纳米颗粒。静脉注射100 μL 0.15 mg/mL探针，连续90分钟采集NIR‑II图像（图8a）。图8b中包括的NIR-II图像在静脉注射后35 min获得，成像结果显示靶向修饰的Ag₂S NPs在胃中受胃炎影响的组织处优先聚集。值得注意的是，与注射T-c-Ag₂S NPs组（图8d）相比，注射T-Ag₂S super NPs组（图8c）的时间演化荧光强度明显高于胃炎炎症部位（图8d）。当使用非靶向PEG-Ag₂S超级NPs或在没有胃炎炎症的情况下，NIR-II图像显示，由于纳米颗粒在肝脏中的保留，注射的NPs优先累积以存活（图8b）。相应的时间演化NIR发射荧光强度（图8e-f）证实了该现象。NIR-II荧光图像显示T-Ag₂S超纳米粒和T-c-Ag₂S纳米粒对胃炎具有成功的体内靶向性。更重要的是，该结果进一步突出了Ag₂S超级纳米颗粒的优越体内成像性能，其特征是在低剂量注射条件下比市售Ag₂S纳米颗粒具有更高的亮度。

基于上述胃炎炎症成像结果，随后开展了体内心肌炎成像。以20 mg/mL浓度的LPS溶液（每只小鼠总剂量30 mg/kg）腹腔注射至小鼠体内，随后连续监测生理状态3天，直至心肌炎模型成功建立。为了实现明亮和靶向成像，将4周龄雌性小鼠随机分为四组：（1）心肌炎 + T-Ag₂S super NPs；（2）心肌炎 + T-commercial Ag₂S NPs（T-c-Ag₂S NPs）；（3）心肌炎 + PEG-Ag₂S super NPs；（4）健康 + T-Ag₂S super NPs。每组小鼠静脉注射分散在PBS中的相应NPs（100 µL，0.15 mg/mL），并持续进行NIR-II成像，每5分钟一次，总时长90分钟。图8g中心肌炎成像所包含的NIR-II荧光图像是在静脉注射后30分钟获取的。正如预期，经靶向肽修饰的NPs，即T-Ag₂S super NPs和T-c-Ag₂S NPs，在发炎的心脏组织中表现出优先积累。一方面，通过心脏荧光强度随时间变化的观察（图8h-i），可以明显看出T-Ag₂S super NPs的亮度比T-c-Ag₂S NPs提高了90%以上。另一方面，未经靶向肽修饰的NPs则主要优先积累于肝脏（图8j-k）。以上所有结果进一步揭示了所合成的PEG-Ag₂S super NPs在低剂量、高亮度、高质量体内炎症成像中的卓越能力。

数十年来，Ag₂S纳米颗粒因优异光学性能被视为极具前景的NIR‑II光学探针，但其临床前应用受限于亮度偏低。本研究提出快速、低成本、高效的微波辐照策略，使Ag₂S纳米颗粒量子产率提升25倍，最优条件为210 W、2分钟。该增强需严格满足：Ag纳米颗粒与CHCl₃同时存在。增强机制为：微波使Ag纳米颗粒降解产生高活性Ag⁺，与CHCl₃反应生成AgCl并原位沉积于Ag₂S表面，大幅抑制非辐射过程，显著提升亮度与荧光寿命。

PEG修饰后的PEG‑Ag₂S超级纳米颗粒可实现低激发剂量、低给药剂量体内成像；MTT实验、28天生化与组织学分析证实其低毒性。偶联靶向肽后，在体内外炎症靶向成像中性能突出，荧光强度较商用Ag₂S纳米颗粒提升90%以上，为未来临床早期病灶检测奠定基础。本研究提供快速、低成本、均相原位策略制备超高亮度Ag₂S纳米颗粒，为开发更高亮度光学探针的合成方法提供新思路。研究结果为发光增强型Ag₂S纳米颗粒在转移瘤、神经炎症等复杂疾病模型中严格验证临床前成像效果、推动诊疗转化应用提供坚实基础。

参考文献

Ruan D, Hu C, Yang Z, et al. Rapid in situ microwave-assisted fabrication of ultrabright near-infrared probe for low-dose in vivo inflammatory imaging[J]. Journal of Nanobiotechnology, 2025, 23(1): 606.

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