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一、引言
在药物研发阶段，新型化合物对主要细胞色素P450（CYP）酶的体外诱导潜能评估是关键环节，传统方法多采用三明治培养的原代人肝细胞（PHH）。尽管PHH结合监管指南往往能较合理地预测临床诱导风险，但对于新一代的肝细胞模型在CYP诱导评估中的表现，目前仍缺乏充分认知。

本研究评估了一种新型的全人源肝细胞三培养系统(TCS)，用于检测主要CYP和核受体的基础表达水平，以及在原型诱导剂处理后CYP的诱导水平。这些结果将为TCS在体外诱导研究中的进一步应用提供基础数据支持，并为探索TCS能否克服PHH存在的相关挑战（如CYP2C酶诱导评估难题）提供重要参考。

二、材料与方法
1、4周培养期内基因基础表达水平的评估

• 将原代人肝细胞（PHH）和饲养细胞接种到24孔胶原包被板上，构建三培养体系（TCS）；
• 在4周培养期内的特定时间点，向孔中加入Trizol试剂裂解细胞；
• 采用氯仿萃取法分离RNA，使用SuperScript IV VILO试剂盒合成cDNA；
• 使用QuantStudio7实时荧光定量PCR系统上的TaqMan芯片检测法评估基因表达。与第1天的表达量相比，使用ΔΔCt法计算倍数变化。

2、评估CYP表达对原型诱导剂的反应

1. 将原代人肝细胞（PHH）和饲养细胞接种到96孔胶原包被板上，构建三培养体系（TCS）；
2. 培养至第10天，向孔中加入含不同浓度原型诱导剂（含0.1%二甲基亚砜）的培养基（表1）；
3. 细胞暴露于诱导剂48小时，前24小时后更换新鲜培养基和诱导剂；
4. 48小时后，移除培养基，使用mRNA Catcher PLUS纯化试剂盒收集各孔中的RNA；
5. 采用Super Script IV VILO试剂盒合成cDNA，通过QuantStudio7实时荧光定量PCR系统结合TaqMan探针检测法评估基因表达水平，采用ΔΔCt法计算相对于溶媒对照组的倍数变化；
6. 使用GraphPad Prism软件，通过S型曲线拟合数据来确定Emax和EC₅₀值。

表1.针对阳性诱导剂处理后诱导潜能评估的CYP酶列表
 

表2.肝细胞供体（1921756）信息

三、结果
1、三培养体系（TCS）研究中内参基因的筛选
结果显示，各内参基因的Ct值存在差异（图1）。其中GAPDH在培养期间的Ct值具有良好的一致性，因此被选为理想的内参基因。

图1.4周培养期内各内参基因表达水平的评估。每个圆点代表第1、4、7、12、17、23或30天的基因表达水平。

表3.各内参基因的Ct值统计数据

2、4周培养期内TCS中CYP酶和核受体的基础表达水平
如图2所示，在TCS建立后的4-12天内，除CYP1A1和CYP2E1外，其余CYP酶和核受体的表达水平均明显升高。大多数受测基因的表达水平在培养第7-12天达到峰值，因此后续的诱导研究选择在培养第10天启动。

图2.在基础培养条件下，于4周培养期内的不同时间点检测TCS中各CYP酶和核受体的基因表达水平。

3、原型诱导剂暴露48小时后主要CYP酶的诱导潜能
经不同浓度原型诱导剂处理48小时后，TCS中所有主要CYP酶均表现出明显的诱导潜能，包括CYP2C家族各亚型（图3）。各酶的最大诱导倍数（Eₘₐₓ）和半数效应浓度（EC₅₀）数据见表4。此外，在所有主要CYP酶的测试中，当诱导剂浓度达到最高值时，诱导潜能均呈现下降趋势。

图3.三培养体系（TCS）经不同浓度的多种原型诱导剂处理48小时后，检测各CYP酶的基因表达水平。表达水平以相对于溶媒对照组的倍数变化表示（n=4），通过将曲线限定在观察到的最高倍数变化值，确定各酶的最大诱导倍数（Eₘₐₓ）和半数效应浓度（EC₅₀）

表4.各CYP酶的最大诱导倍数（Eₘₐₓ）和半数效应浓度（EC₅₀）

四、结论

1. TCS建立后的4-12天内，除CYP1A1和CYP2E1外，CYP酶和核受体的表达水平明显升高；
2. 大多数受测基因在TCS中的表达水平于第7-12天达到峰值；
3. 主要CYP酶在TCS中均对原型诱导剂具有高度诱导性，包括CYP2C酶；
4. 在主要CYP酶的测试中，当诱导剂浓度达到最高值时，诱导潜能均有所下降。