细胞收缩与钙成像标测系统助力hiPSC来源心肌球动作电位与钙信号采集
2026-06-01 来源:本站 点击次数:52人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的心肌球，可在三维结构下模拟心肌组织的细胞微环境、自律性搏动及兴奋-收缩耦联生理特征，是研究心肌生理功能、心律失常发病机制及药物心脏安全性评价的理想体外模型。
心肌的生理活动以动作电位为电活动起始，经由钙触发钙释放产生胞内钙瞬变，进而驱动心肌节律性收缩，电活动与钙信号的时序匹配、动态稳态是维持心肌正常节律与收缩功能的核心基础。因此同步检测心肌球动作电位与钙信号，对解析心肌兴奋-收缩耦联机制、评估心肌细胞成熟度、进行药物心脏安全性评价等具有重要意义。
实验目的：本实验以hiPSC分化心肌细胞构建三维心肌球模型，采用Rhod-2 AM与RH237荧光双染方法，使用MappingLab细胞收缩与钙成像标测系统同步检测动作电位与钙信号，建立稳定的电-钙活动同步检测技术。
实验对象：
hiPSC定向分化获得的心肌细胞，经超低吸附培养体系自组装形成三维心肌球，培养至第7天，选取节律搏动稳定者作为检测对象。
实验原理：
Rhod-2 AM钙指示剂可特异性标记胞内钙瞬变特征，RH237电压敏感染料能随细胞膜电位变化反映动作电位特征；借助细胞收缩与钙成像标测系统分光采集成像，可同步捕捉心肌球电活动与钙信号动态。
Protocol（心肌球动作电位与钙信号检测案例）
一、实验前准备
（一）主要试剂：
Pluronic F127、Rhod-2 AM、RH237、无水DMSO、RPMI 1640培养基、B27添加剂、FBS、Y-27632、TrypLE™ Select消化酶、1.8 mM含钙台氏液。
（二）主要溶液配方：
1. 培养基：RPMI 1640+B27
2. 消化酶：TrypLE™ Select 酶 (10X)
3. 含钙台氏液（1.8mM）
二、实验步骤
（一）三维心肌球制备
1. 取hiPSC诱导分化的心肌细胞，经TrypLE™ Select酶温和消化后，离心收集细胞并进行细胞计数，用RPMI 1640+B27 +10%FBS+10 μM Y-27632培养基重悬。
2. 将细胞悬液接种至超低吸附96 孔超低吸附U型底板，每孔加入100 μL 细胞悬液（约含10000～20000 个细胞），转速为1000 rpm，离心3 min，使细胞聚集于孔底，次日更换培养基为RPMI 1640+B27。
3. 将培养板置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱静置培养，24～48 h内细胞可自发聚集形成规则三维心肌球，培养48 h后显微镜下可观察到自主节律性搏动。
4. 培养期间每2天半量更换新鲜RPMI 1640+B27培养基，清除代谢废物、补充营养，成球后培养至第7天，选取800 μm左右、搏动稳定的心肌球用于后续染色与检测实验。
（二）Rhod-2 AM与RH237共染
1. Rhod-2 AM母液及工作液配制：取Rhod-2 AM粉末，用无水DMSO充分溶解配制成5 mM 母液，避光分装后-20 ℃冻存；实验前取分装母液，用含0.1% Pluronic F127的预热含钙台氏液稀释至终浓度2.5 μM，轻柔涡旋混匀备用。
2. 从培养箱取出心肌球，用37 ℃预热含钙台氏液轻柔洗涤1～2 次，去除残留培养基、代谢废物及血清成分，避免干扰染料负载。
3. 弃去洗涤液，加入配制好的Rhod-2 AM工作液，完全浸没心肌球，置于37 ℃培养箱避光孵育30 min。
4. 孵育结束后吸弃染液，用预热含钙台氏液漂洗1 次，去除胞外游离染料及残留AM酯。
5. RH237母液及工作液配制：RH237粉末用无水DMSO溶解，配制成1～10 mM母液，避光分装-20 ℃保存；实验前用预热含钙台氏液稀释至工作浓度0.5～5 μM，涡旋混匀。
6. 再次用预热含钙台氏液轻柔洗涤心肌球1～2 次，弃废液，加入完全覆盖心肌球的RH237工作液。
7. 37 ℃条件下避光孵育15～30 min，完成细胞膜电压探针标记。
8. 孵育完毕吸弃染液，用预热台氏液充分漂洗心肌球，洗去未特异性结合的游离染料，降低背景荧光干扰，保留膜上特异性荧光信号。
（三）荧光信号同步检测（全程避光操作）
将充分漂洗后的心肌球转移至盛有37 ℃预热含钙台氏液的检测浴槽中，采用双路520 nm LED光源激发样本荧光，通过细胞收缩与钙成像标测系统实时采集、同步记录心肌球动作电位与钙瞬变荧光动态信号。
