Protocol（神经-肌肉接头类器官电生理信号检测）

一、实验前准备
（一）主要试剂：
Rhod2-AM (Abcam, AB142780)、FluoVolt（Thermo Fisher, F10488）、无水乙醇/二甲亚砜（染料助溶）、去离子水等。

（二）主要溶液配方：
1. 1.8 mM含钙台氏液

2. 荧光染料工作液
Rhod2-AM（5 μM）：取5 mM储备液，用1.8 mM含钙台氏液稀释至1/1000，避光保存，2小时内使用。

FluoVolt：按照说明书用1.8 mM含钙台氏液稀释至1/1000，现配现用，避光操作。

二、实验步骤
实验一：钙信号检测
1. 取制备好的神经-肌肉接头类器官，加入终浓度5 μM 的Rhod2-AM荧光工作液，置于37 ℃恒温条件下避光孵育30 min，使染料充分负载标记胞内钙信号。
2. 吸弃多余染料工作液，采用1.8 mM含钙台氏液轻轻漂洗1 次，洗去未结合的游离荧光染料。
3. 连接电生理系统，设置刺激参数：电压20 V、波宽2 ms、频率1 Hz；同步开启钙成像采集，实时记录神经与肌肉区域钙荧光信号变化，保存原始数据备用。

实验二：动作电位（AP）检测
1. 取神经-肌肉接头类器官，加入FluoVolt工作液，37 °C避光孵育20分钟，对细胞膜电位进行特异性荧光标记。
2. 孵育结束后吸弃工作液，用1.8 mM含钙台氏液漂洗1 次，去除未特异性结合的游离染料。
3. 置于细胞收缩与钙成像系统上机检测，固定刺激电压20 V、波宽2 ms，分别设置1 Hz、2 Hz、3 Hz梯度刺激频率；记录不同频率下神经端动作电位荧光信号变化。

实验三：肌肉收缩与强直特性检测
1. 全程保持样本浸润于1.8 mM含钙台氏液生理环境中，调整电刺激参数为电压20 V、波宽2 ms、频率100 Hz 高频持续刺激，同步实时记录类器官收缩节律与强直收缩形成全过程，分析兴奋-收缩耦联特征。

三、实验结果
结果一：神经-肌肉接头类器官钙信号
神经端和肌肉端均能正常响应电刺激，产生钙信号。

上图为神经-肌肉接头类器官示意图；

上图为20 V-2 ms-1 Hz刺激下，神经端、肌肉端的钙信号波形

神经-肌肉接头类器官Active time传导视频

神经-肌肉接头类器官钙信号传导视频

结果二：神经端AP信号
神经端记录到低幅、窄的动作电位，在低频（1-2 Hz）状态下，神经元可以稳定地跟随刺激，动作电位正常发放，证明其基础兴奋性和传导功能正常；当刺激频率升高到3 Hz时，神经元的电活动出现异常，出现了额外发放和幅度不均的现象。

不同频率刺激下神经端的AP波形

结果三：肌肉端强直收缩信号
低频刺激阶段（20 V 2 ms 1 Hz）：钙信号和收缩曲线都呈现周期性的小幅度波动，即单个刺激引起的单收缩反应。

高频刺激阶段（20 V 2 ms 100 Hz）：刺激频率升高后，钙信号和收缩曲线都融合成了一个平滑的、持续的平台状曲线，即强直收缩（tetanus）。

直观地展示了肌肉收缩的兴奋-收缩耦联过程，高频刺激导致胞内Ca²⁺持续升高，引发肌肉的持续收缩。演示了高频刺激→钙信号持续升高→肌肉产生强直收缩的完整过程。

本实验应用的神经-肌肉接头类器官由西湖大学生命科学学院特聘研究员雷凯教授提供。

本实验由河南省医学科学院电生理研究所与斯高研究院联合共创，如您对相关技术感兴趣，欢迎前来河南省医学科学院电生理研究所参观交流。