BIAcore是一种基于光学表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，简称SPR）原理用于分子互作分析的常用方法。因为其无需标记、准确性高、重复性好、应用广泛，目前SPR原理用于药物分析的方法已经被录入中国、美国、日本的药典。抗体药物偶联物（ADC）具有靶向性强，副作用小，药效更强，适应症广等特点，其分子结构复杂度显著高于传统单克隆抗体。抗体药物偶联物的靶点筛选、抗体动力学表征、抗原表位定位及分子优化等多个研发环节，Biacore在ADC药物精准化设计和开发过程中起到不可替代的作用。

经酶联免疫吸附实验（ELISA）初筛阳性、具备开发为抗体药物偶联物潜力的候选抗体，通过Biacore技术可用于开展多维度表征检测，分析指标包含特异性、结合动力学 / 亲和力、连接子结合带来的影响、药物抗体比产生的作用，以及胞内体 pH 环境对抗体 — 抗原结合作用的影响。

Biacore检测分析可以得到关键动力学参数，同时明确了偶联修饰、胞内体 pH 对候选抗体的调控规律。这些数据不仅可以解释细胞水平实验中抗体药物偶联物药效差异背后的原因，也为理性筛选抗体、优化抗体药物偶联物分子设计提供重要依据。

具体我们用一个案例来看一下：

实验采用 Biacore T200设备，对四款靶向晚期糖基化终末产物受体（RAGE） 的抗体药物偶联物进行表征。

Biacore总体实验方法：

1、仪器和耗材
仪器：Biacore T200
芯片：CM5芯片（货号：BR100530）
试剂盒：氨基偶联试剂盒（货号：BR100050），小鼠抗体捕获试剂盒（货号：BR100838）
缓冲液：HBS-EP缓冲液（货号：BR100669）

2、抗体偶联：
利用氨基偶联试剂盒固定抗小鼠抗体。所有流路通道均固定抗小鼠抗体，其中 1 号、3 号通道分别作为 2 号、4 号样品通道的参比通道。动力学实验中，抗体捕获量通常控制在 500~1000 响应单位（RU）。

3、进样和检测
采用单循环动力学模式，设置 5 个浓度梯度，按浓度由低到高的顺序，将重组蛋白依次通入参比通道与样品通道，进样时长 60 秒。每轮结合反应结束后，通入捕获试剂盒中的再生液冲洗 180 秒，洗脱结合的抗体，完成芯片再生。更换待测抗体前，需运行空白循环（依次进样抗体、缓冲液，再进行再生）。

4、数据分析
数据采用双重参比法校正：先扣除参比通道的响应信号，再扣除空白循环背景；最终使用 Biacore T200分析软件，将数据拟合至一对一结合模型。

实验结果1：Biacore助力抗体克隆筛选
本研究借助 UniProt、NHLBI-AbDesigner 在线工具，对晚期糖基化终末产物受体（RAGE）蛋白开展免疫原性分析与序列比对。本研究除利用完整 RAGE 蛋白制备抗体外，还尝试针对该蛋白特定区域设计抗体。研究重点选取 RAGE 蛋白中高度保守、免疫原性强的区段，以此制备抗体，保证后续抗体药物偶联物可作用于多种 RAGE 亚型；同时选取跨膜区附近的胞外区段，确保在 RAGE 胞外域脱落的情况下，药物仍可有效靶向结合靶点。

本实验采用氨基偶联抗小鼠抗体的方式，将待测抗体捕获于 CM5 传感芯片，使用浓度 2.5~200 nM 的重组 RAGE 蛋白开展动力学检测。

Biacore结果显示：RBGO1抗体克隆株与重组 RAGE 蛋白亲和力极高，达到皮摩尔级别；其余三株抗体结合能力微弱甚至无结合。

实验结果2：Biacore分析抗体偶联工艺对抗原结合能力的影响
为探究药物 - 连接子偶联带来的影响，本研究选取RBGO1抗体开展实验：分别采用溶酶体可裂解型缬氨酸 - 瓜氨酸二肽连接子（vc）偶联单甲基奥瑞他汀 E（MMAE，简称 vcE）、不可裂解型马来酰亚胺己酰连接子（mc）偶联单甲基奥瑞他汀 F（MMAF，简称 mcF）进行偶联修饰；随后通过氨基偶联抗小鼠抗体，将偶联产物固定于 CM5 传感芯片上。

分别检测偶联前后的抗体结合动力学：RBGO1 以重组 RAGE 蛋白（2.5~200 nM）为分析对象，并采用一对一结合模型计算结合、解离速率常数。

Biacore结果显示：RBGO1 偶联前后KD无明显变化（偶联后KD=0.63±0.02 nM，未偶联组KD=0.67±0.03 nM）。

实验结果3：Biacore分析可裂解与不可裂解连接子对结合动力学的影响
为进一步探究偶联工艺对结合动力学的影响，本研究对比了可裂解连接子与不可裂解连接子分别对 RBGO1抗体抗原结合亲和力的作用。将RBGO1抗体通过缬氨酸 - 瓜氨酸连接子偶联 MMAE（vcE）、马来酰亚胺己酰连接子偶联 MMAF（mcF），对比偶联前后的结合动力学参数。

实验通过氨基偶联抗小鼠抗体，将RBGO1抗体固定于 CM5 传感芯片；RBGO1 检测体系采用重组 RAGE 蛋白（2.5~200 nM）并测定结合、解离速率。

Biacore结果表明：RBGO1 经两种连接子偶联后，ka与kd均未出现明显变化。

实验结果4：Biacore检测药物抗体比对RAGE靶向候选抗体药物偶联物的结合亲和力的影响

上述实验结果表明，RBGO1 抗体对天然重组 RAGE 蛋白亲和力高、结合动力学表现优异（结合快、解离慢），且偶联后结合活性未出现衰减，是最具备药物开发潜力的候选分子。

本研究通过调整抗体与三 (2 - 羧乙基) 膦（TCEP）的摩尔比，制备出低药物抗体比（DAR）和高药物抗体比的 RBGO1 型抗体药物偶联物。

将未偶联的 RBGO1 抗体、低 DAR 及高 DAR 的 RBGO1-ADC，依次捕获至CM5 传感芯片，实验采用 2.5~200 nM 的重组 RAGE 蛋白开展动力学检测，测定结合与解离速率。

Biacore结果显示：无论是低 DAR 还是高 DAR 的偶联产物，其结合速率常数、解离速率常数与原始未偶联抗体相比均无显著差异，说明载药量高低不会影响 RBGO1-ADC 的抗原结合能力。

实验结果5：Biacore检测pH对重组 RAGE 与 RBGO1-ADC 的解离速率的影响
细胞表面受体持续内吞进入胞内体，是抗体药物偶联物（ADC）发挥药效的关键。该过程能将 ADC 所携带的毒性药物递送至细胞内部，而细胞毒性药物也主要在胞内发挥作用。因此，全面解析 ADC 的胞内转运分子机制，对其分子设计与候选分子筛选至关重要。

本研究进一步探究胞内体微环境对抗原 - 抗体解离行为的影响，同时分析偶联修饰是否会在酸性胞内体环境下，进一步改变候选抗体的结合动力学。实验利用 Biacore T200 系统的双进样功能，可在保持运行缓冲液不变的前提下，连续通入两种不同溶液。

实验使用CM5 传感芯片，分别固定未偶联的 RBGO1 抗体、高药物抗体比的 RBGO1-vcE 型 ADC。先在生理 pH 7.4 条件下完成抗体 / ADC 与重组 RAGE 蛋白的结合，随后分别在 pH 7.4（胞外环境）与 pH 6.0（胞内体环境）条件下检测解离动力学，重组 RAGE 蛋白浓度设置为 10 nM。

Biacore结果显示：相较于 pH 7.4 环境，pH 6.0 酸性条件下，RBGO1 与重组 RAGE 的解离速率明显加快；180 秒内的解离比例分别为 45%（pH 6.0）与 25%（pH 7.4），该特性符合优质 ADC 的设计要求。此外，RBGO1 经偶联修饰后，在 pH 6.0 环境中的解离速率未发生明显改变。

Biacore具有无需标记、准确性高、灵敏度高、重复性好等特点，已广泛应用于常规抗体类生物药的筛选与研发，且在抗体药物偶联物的靶点筛选、抗体动力学表征、抗原表位定位及分子优化等多个研发环节的使用也日益增多。基于 Biacore平台的表面等离子体共振技术可获取丰富的分子作用信息，能够满足快速、高通量筛选的需求，进而推动抗体药物偶联物的研发进程。