骨质疏松等骨代谢疾病，伴随人口老龄化的不断加速，已成为全球重大公共卫生挑战。目前仍缺乏可模拟骨组织内多细胞协同交互的体外模型，进而限制了新型药物靶点的发现与治疗策略的研发转化。

来自比利时布鲁塞尔自由大学（VUB）与瑞士洛桑联邦理工学院（EPFL）的研究团队，利用德国M2-Automation公司的非接触式微阵列生物芯片点样仪（iTWO-400），成功构建了骨细胞微阵列芯片，首次证实了在流体剪切力加载条件下，骨细胞（osteocyte）与成骨细胞（osteoblast）之间通过Cx43间隙连接完成通讯。题为“Development of bone cell microarrays in microfluidic chips for studying osteocyte-osteoblast communication under fluid flow mechanical loading”，在生物制造领域权威期刊Biofabrication上发表。

该文章利用高精度非接触式点样技术，将荧光标记的成骨细胞（MC3T3-E1，绿色）与骨细胞（MLO-Y4，红色）以预设图案点印于玻璃基底或微流控通道内。通过调控细胞密度与点间距，48小时内诱导相邻细胞点形成清晰、线性的异型细胞-细胞接触界面，并在此界面上验证了Connexin 43（Cx43）间隙连接蛋白的高表达。随后，结合原子力显微镜（AFM）单细胞纳米压痕与流体剪切应力（FFSS）刺激，成功捕捉到由骨细胞发起、通过功能性Cx43间隙连接传递至成骨细胞的钙波（Ca²⁺ wave）信号，再现了体内骨组织对机械载荷的协同响应过程。

首先，M2 iTWO细胞微阵列点样仪将骨细胞和成骨细胞高精度、非接触式点印在玻璃盖玻片和微流控芯片上（图1）。通过优化喷液压力、脉冲时间、点样间距等参数，既保证了微流控芯片内的空间兼容性，又确保了相邻细胞点能快速形成通信界面，同时避免过早融合（图2a-c）。

图1 细胞微阵列芯片点印流程示意图：从常规培养皿中收获成骨细胞（OB）与骨细胞（OY），分别采用绿色、红色荧光染料标记，随后移入非接触式全自动点样仪的源板，将骨细胞样本以多种排布样式，点印于细胞培养皿或玻璃盖玻片上，盖玻片后续粘贴密封制备微流控通道

图2 细胞微阵列芯片点印参数优化与细胞存活率检测，(a)纯水5×5点阵的阵列，单点1滴；点印条件：压力100mbar、电磁阀开启脉冲(PDP) 820ms、保持脉冲(PDH) 860ms、点印频率5Hz、点间距1mm；(b) 分别在100、200、300mbar压力（单点1滴）与 100mbar压力（单点2滴）条件下制备纯水5×5阵列，统计各组液滴平均直径；误差棒代表标准差，p＜0.0001；(c) 纯水5×5点阵的阵列，单点点印2滴，点印参数同 (a)；(d) 成骨细胞（OB1/2/3，3组平行样本）、骨细胞（OY1/2/3，3组平行样本）点印后活细胞与死细胞占比统计，误差棒为标准差；(e) 点印40 min（t40）后，成骨细胞、骨细胞三组平行样本的平均细胞贴壁率，误差棒为标准差

基于M2微阵列生物芯片点样仪的高精度与高生物相容性，点印后的成骨细胞与骨细胞即时存活率均接近100%，40分钟贴壁率亦高于90%（图2d-e），在后续4天内仍保持典型的成纤维样或星形树突状形态，未见明显表型改变。

研究团队据此设计了6种不同的细胞微阵列芯片图案（包括并列阵列、花形结构等），在微流控通道内成骨细胞与骨细胞之间构建了多个局部异型界面。其中，构型4采用750 μm间距将两列成骨细胞与两列骨细胞并列排布，24小时内即在中央形成10条垂直异型界面，边界清晰、线性度良好（图3a）；构型5与构型6则采用花形结构，使中央细胞点与周围6个细胞点形成6条异型界面，显著增加了单点周围的通信节点数量（图3b-c）。高倍荧光成像显示，Cx43蛋白富集于异型细胞-细胞接触处，呈现为明亮的青色点状信号（图3c, 橙色圆圈）。

图3 三种可促成成骨细胞与骨细胞形成定点异源性细胞交互界面的细胞微阵列芯片构型，(a)构型4：中心区域成对排布的成骨细胞与骨细胞初始间距750 μm，培养24 h后相互靠拢，形成竖向细胞交界。黄色虚线框放大区域可见，两种细胞的分界边缘规整，培养至48 h仍保持清晰边界；(b)构型5：中心单斑成骨细胞可与外周六处骨细胞斑点形成6处交互界面，黄色虚线放大图同样显示两类细胞界限分明；(c)构型6：培养48 h后，成骨细胞与骨细胞在6个固定点位形成细胞作用界面，明场放大图中可见两个成骨细胞与一个骨细胞相互接触，高倍放大视野里，橙色圈标注的亮青色点位即为分布在细胞连接处的Cx43蛋白。图中绿色代表成骨细胞，红色代表骨细胞，半透明橙色条带代表不同斑点间的异源细胞接触界面，(a)(b)中肌动蛋白纤维标记为青色，(c)中肌动蛋白纤维呈品红色，Cx43蛋白显示为青色

在细胞微阵列生物芯片基础上，研究团队利用荧光显微镜和AFM进一步验证了Cx43间隙连接在骨细胞与成骨细胞之间介导了钙信号的快速传递。通过对骨细胞微阵列施加流体剪切力，研究还证明了骨细胞对流体剪切力更为敏感，在力学感知中起主导作用。这些结果表明，M2高精度微阵列生物芯片点样仪打印的骨细胞微阵列完全兼容后续高精度力学加载和成像分析，为骨代谢研究提供了可靠的细胞模型。

M2-Automation成立于2003年，总部位于德国柏林，是一家创新技术开发公司，专注于皮升/纳升级-超微量/微量、非接触式自动化移液和微阵列生物芯片点样技术。

• 精准性好：最小液滴体积30pL、点样CV≤ 2%

• 位移精度高：机械臂精度1µm，重复定位精度3µm

• 灵活性好：4类喷点模块可由操作者自行选择和轻松更换，非接触式压电点样头（pL 皮升点样）、电磁阀点样头（nL 纳升点样）、M2专利点样头（10 nL-μL点样），和接触式针式点样头

• 耗材成本低：专利M2MD喷点模块，拥有 nL 级非接触式点样领域少见的塑料枪头可替换设计

• 稳定性高：在线负压除气和过滤装置，避免系统液管路微小残留气泡对点样的影响

• 配置灵活：可选配温、湿度控制和空气净化模块

• 软件易用：InDOT软件无需编程，鼠标拖拉功能图标即可实现芯片点样的程序设计

应用方向：

• 基因芯片：分子互作验证、疾病功能基因检测或筛选等

• 蛋白质芯片：功能蛋白质筛选、抗原表位筛选、生物靶点筛选等

• 多糖芯片：进行糖功能学、糖蛋白、植物凝集素等研究等

• 小分子化合物芯片：药物筛选、疾病研究、疾病标志物筛选等

• 细胞芯片：细胞代谢机制研究、细胞信号通路研究、细胞膜受体研究等

• 微阵列SRPi镀金芯片：分子互作研究等

• 微孔板芯片：多重因子检测、微型ELISA等

• 微流控芯片、生物传感器芯片：药物研发、体外诊断、生物半导体研发等

• 临床快检POCT芯片：抗原抗体检测、过敏原检测、病原微生物检测等

• 生物传感器芯片/电化学芯片：CGM连续性血糖监测、血脂监测等

• 微针、微柱点样：透皮给药、缓释给药等

• 液体灌注、填充、清洗、移液、分液工作站等

环亚生物科技（APG BIO）作为德国M2-Automation公司中国区独家代理，为客户提供生物芯片点样、扫描以及高通量筛选的整体解决方案和服务。