双光子光声显微成像 技术用于测单细胞脑神经代谢活动
2026-07-22 来源:本站 点击次数:64大脑正常功能依赖神经元活动与局部能量代谢的精准协同，氧在单个神经元与红细胞之间的交换是这一过程的核心，但现有成像技术无法在活体单细胞分辨率下同步捕捉二者的动态变化。该研究构建了集成双光子与光声显微成像的TPM-PAM 平台，可在清醒小鼠体内实时记录单个神经元的钙活动与单个红细胞的氧释放过程；该平台结合细胞级精度的神经血管单元非线性光学操控技术，系统揭示了胡须刺激、单毛细血管阻塞、单神经元刺激三种场景下的差异化神经代谢响应，为解析细胞尺度的神经代谢耦合机制、研究脑健康与疾病中的氧代谢调控提供了全新的实验手段。
该研究由Jiaxiao Han、Youngseop Lee、Ziang Feng 等学者完成，通讯作者为 Song Hu，论文题为 《Integrated two-photon and photoacoustic microscopy for single-cell neurometabolic imaging》，于 2026年7月在线发表于 《Nature Communications》。
重要发现
01TPM-PAM 系统的核心技术架构为实现单细胞分辨率的全光学神经代谢成像与操控，研究团队从三个维度突破了现有多模态成像的技术局限。在超声探测端，研发了基于透明聚合物的微环谐振器超声传感器，通过软纳米压印光刻工艺在涂覆旋涂玻璃的衬底上制备微环与耦合波导结构，引入绝热锥形波导降低与单模光纤的模式失配，同时优化包层与衬底材料提升水- 波导界面的声学阻抗匹配。上述设计将耦合效率提升4倍、品质因数提升5倍，最终超声探测灵敏度较前代方案提升一个数量级以上。该传感器总厚度仅370 μm，具备光学透明特性，可直接置于短工作距离的高数值孔径物镜下方，在实现最高100 MHz 宽带超声探测的同时，不会对活体双光子成像引入可测量的光学像差。
双光子显微镜-光声显微镜（TPM-PAM）的原理图及在清醒表达GCaMP小鼠大脑中的体内性能
在氧代谢定量端，研究团队将光谱测量与描记式扫描相结合，实现了单个红细胞水平的氧饱和度与流速同步定量。扫描过程中，激发光沿用户定义的毛细血管轨迹移动，两个波长的脉冲逐次交替输出；在得到的氧饱和度编码描记图中，对单个红细胞或红细胞团进行分割，通过计算血流方向上的氧饱和度梯度、血流速度与团内红细胞数量的乘积，得到单个红细胞团的氧释放率，累加单条血管内所有红细胞团的数值即可得到血管总氧释放率，进一步通过计算扩散可得到视野内的组织氧递送空间分布。
在靶向操控端，采用与成像光束共焦对齐的飞秒激光脉冲，实现无外源性试剂的精准神经血管扰动。该方案利用非线性光学吸收的空间限域效应，可定向诱导单毛细血管阻塞或激活单个神经元，空间精度达到微米级，同时避免了电刺激空间特异性不足、光遗传学与光声激发存在光谱串扰的问题。
整合上述模块的TPM-PAM 系统共包含四条激光线路：930nm 飞秒脉冲用于双光子成像记录神经元钙活动，545/558nm 纳秒双波长用于光声成像测量红细胞氧代谢，800nm 飞秒脉冲用于靶向单毛细血管或单神经元操控，765-780nm 连续可调谐激光用于微环谐振器的信号探测。系统双光子成像的横向与轴向分辨率分别为 0.7μm 与 2.4μm，光声成像的横向与轴向分辨率分别为 2.5μm 与 15μm，在 200×200μm 的视野下可实现约 3Hz 的成像速率，同步输出神经元钙活动、红细胞血红蛋白浓度、氧饱和度、血流速度与氧释放率等多维度参数。
02活体单细胞神经代谢成像的性能验证
研究团队在清醒头部固定的GCaMP 小鼠开颅窗模型上完成了系统性能验证。在 400×400μm 的大视野下，通过光栅扫描可同步绘制神经元活动分布、血管血红蛋白浓度与血氧饱和度图谱，结合描记扫描可定量不同血管节段的血流速度。将视野缩小至 150×150μm 后，成像帧率提升至 3Hz，可稳定捕捉视野内多个神经元的自发钙活动波动，同时记录对应毛细血管的氧饱和度与血流速度动态变化。通过双波长描记扫描追踪单个红细胞的流动轨迹，可直接观测到单个红细胞流经毛细血管过程中氧饱和度逐步下降的过程，直观呈现了单细胞尺度的氧释放生理过程。
清醒状态下GCaMP小鼠大脑中触须刺激引发的神经代谢反应
03生理刺激下的血管特异性响应规律通过胡须刺激实验，研究团队验证了该平台在生理条件下研究神经代谢耦合的能力。实验在小鼠初级体感桶状皮层开展，共记录9 个神经元与 8 条包含小动脉、小静脉、毛细血管的血管在 10 次刺激中的响应。定量分析显示，不同类型血管的氧代谢响应模式存在显著差异：小动脉的血流速度无明显变化，主要通过管径扩张提升供血能力，管径增幅达 14%，对应容积血流量提升 35%，氧通量提升 39%；小静脉的容积血流量提升 58%，由 38% 的流速提升与 4% 的小幅管径扩张共同驱动，结合 6% 的氧饱和度上升，氧通量整体提升 70%；毛细血管的血流速度、血红蛋白浓度与氧饱和度分别提升 67%、9% 与 10%，氧释放率提升幅度达 113%，全视野范围的氧提取分数下降 10%，提示刺激状态下氧供给超过即时代谢需求。
清醒状态下GCaMP小鼠脑内单根毛细血管闭塞的神经代谢反应
清醒状态下GCaMP小鼠大脑单神经元刺激的神经代谢反应
时间动力学分析显示，血流速度的响应峰值显著早于氧饱和度与血红蛋白浓度，小静脉的容积血流量峰值早于小动脉，毛细血管的氧饱和度响应早于小静脉，这一结果为血流动力学的气球模型提供了直接的实验证据，即小动脉舒张后血流速度即刻上升，而血氧水平因血管顺应性、血液转运时间与氧交换扩散限制呈现更缓慢的变化。
04靶向扰动下的神经代谢耦合定量关系研究团队通过两类靶向扰动实验，定量解析了细胞尺度的神经代谢耦合关系。在单毛细血管阻塞实验中，通过飞秒激光定向诱导单个毛细血管形成血栓，阻塞后目标血管从血管图谱中消失，周边神经元的放电率呈进行性升高，且距离阻塞位点越近的神经元激活程度越强。将视野划分为以阻塞点为中心的四个同心环带分析后发现，神经元平均放电数变化与红细胞氧释放率变化的空间相关系数达0.89，证实局灶缺血后神经元活动增强与代偿性氧释放提升存在强空间耦合关系。
在单神经元刺激实验中，飞秒激光靶向作用于单个神经元细胞膜，触发钙内流并激活目标神经元，同时通过突触网络传播引发周边神经元的次级响应。整体神经元群体活动呈现先瞬时升高、后持续抑制的特征，与单毛细血管阻塞后的持续激活模式存在明显差异。结合氧扩散模型计算每个神经元的局部氧供给变化后，神经元活动变化与氧释放率变化的相关系数为0.48，呈现中等程度的耦合，提示神经元激活驱动的神经代谢调控以前馈信号模式为主。
创新与亮点
该研究突破了多模态神经成像中长期存在的光学通路与声学灵敏度的权衡难题，基于透明微环谐振器的探测方案在保留完整高数值孔径光学通路的同时，实现了宽带高灵敏度超声探测，首次在活体层面同步完成单细胞神经元活动记录与单红细胞氧代谢定量。
研究建立的双波长描记成像方法，将光声氧代谢测量从组织尺度推进至单个红细胞水平，可直接定量红细胞氧释放速率，为微循环氧交换机制研究提供了精准量化工具。集成的飞秒激光非线性操控技术，可在无外源性试剂条件下实现单毛细血管阻塞与单神经元刺激，为解析神经代谢耦合的因果关系提供了可控扰动手段。
该技术可应用于脑功能机制解析、微缺血疾病模型构建、神经退行性疾病代谢机制研究等场景，为神经科学与临床前医学研究提供了全新的多模态成像研究平台。
总结与展望
TPM-PAM 平台突破了单细胞神经代谢成像的技术瓶颈，构建了集多模态成像、定量代谢分析与细胞级靶向扰动于一体的研究体系，为解析细胞尺度的神经代谢耦合机制提供了核心实验工具。未来可通过轴向扩展点扩散函数、解耦双模态扫描方案进一步提升成像通量与探测深度，开发可逆光学操控方法拓展应用场景，推动脑能量代谢研究向更精细的空间尺度延伸。
声明：本文仅用作学术目的。
Han, J., Lee, Y., Feng, Z. et al. Integrated two-photon and photoacoustic microscopy for single-cell neurometabolic imaging. Nat Commun (2026).
doi: https://doi.org/10.1038/s41467-026-75603-7