在生物学研究中，你是不是经常会碰到这类问题：
想要对表达目的基因的细胞进行示踪，不知如何将目的基因与荧光蛋白进行连接？
想要用一个载体同时表达多个基因，不知如何将多个基因进行连接？
这两个需求在构建转基因小鼠的过程中尤其常见。本期，小编就带大家聊聊多基因表达的连接元件选择：IRES 和 2A 到底该怎么选。

一、多基因表达有哪些方案
要实现多基因同时表达，通常有这么几种方法：
构建多个表达框，用多个启动子启动多个转录本转录以表达多个基因。
在基因之间插入蛋白水解切割位点，利用蛋白水解加工（proteolytic processing）的方法对同一个转录本翻译的融合蛋白进行分离。
在基因之间插入内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）。
在基因之间插入自剪切多肽2A（self-cleaving 2A peptide，2A）结构。
其中应用最广泛、最成熟的是采用多顺反子表达的方案，也就是我们经常遇见的用IRES和2A元件连接前后两个基因。

二、IRES元件——同时转录，独立翻译
真核生物的蛋白翻译主要依赖于mRNA的5'帽子结构。但在真核生物和一些RNA病毒中也存在例外情况——对于缺乏帽子结构的RNA病毒，其蛋白合成起始是依赖于5'端非编码区的一段特殊序列，这段非编码mRNA即IRES。IRES的存在允许核糖体直接结合mRNA起始翻译。因此，当在两个基因中间插入IRES元件，上游蛋白依靠5'帽子结构起始翻译，下游蛋白则依靠IRES起始翻译。

Fig.1 真核生物mRNA图示

IRES的优点：
两个蛋白可以同时表达，且翻译出的两个蛋白是完全独立的，不存在残留肽段。

IRES的不足：
序列较长（约600bp），无法像原核SD序列一样通过引物扩增添加，应用常受到载体容量的限制。

无法实现前后两个蛋白的等量表达——IRES的存在有可能影响mRNA的结构，加上IRES和mRNA的5'帽子对核糖体/翻译起始复合物的结合力不同。通常情况下，下游蛋白的表达量仅为上游蛋白的10%~50%。

那么如何能够实现上下游蛋白的等量表达呢？下面这个元件可以给你帮助。

三、2A元件——同时转录，同时翻译
2A肽是Ryan和他的同事在口蹄疫病毒（FMDV）中发现的一种"自我切割"的小肽，此外在其它病毒中也发现了2A肽类似序列，其平均长度为18-22个氨基酸，且具有高度保守的C末端序列：-DxExNPGP-。

核心机制：2A元件会导致核糖体跳过2A肽C末端的甘氨酰（G）—脯氨酰（P）肽键的合成，从而"断裂"为两个独立的蛋白。这个过程被形象地称为**"核糖体跳跃"**。

Fig.2 口蹄疫病毒(FMDV)中2A肽的自剪切

2A肽的优势：
等量表达：2A肽的剪切效率极高，昆虫病毒和猪捷申病毒中的2A切割效率几乎是100%，能够实现多蛋白的等量表达。

长度小：一个典型的序列为EGRGSLLTCGDVEENPG*P（*为切割位点），其DNA序列为54bp，可以通过长引物PCR引入基因中。

多基因连接优势明显：尤其是连接多个基因的时候优势更加明显。也可以将2A及IRES结合使用。查找Addgene现有载体构建数据，对于三基因、四基因之间的连接，连接元件组合使用频率：2A/2A > 2A/IRES > IRES/IRES。

四、4种常用2A肽的切割效率比较
目前已鉴定出多种2A多肽，其中常用的有4种：
F2A（口蹄疫病毒）
E2A（马鼻炎A病毒）
P2A（猪圆环病毒1）
T2A（TaV）

为比较4种2A的切割效率，研究人员将构建的sCMV-NLS-EGFP-2A-mCherry-CAAX质粒分别转染HEK293T、HT1080、Hela细胞系、斑马鱼胚胎；将sCMV-NLS-EGFP-2A-mCherry-CAAX包装成腺病毒，对小鼠进行尾静脉注射，观察其表达情况。结果发现：无论是在人细胞系，还是在斑马鱼胚胎中，或小鼠组织中，P2A的切割效率均是最高的。
 

Fig.3 不同2A肽的DNA及相应氨基酸序列，带下划线的序列编码氨基酸GSG，添加GSG可以提高剪切效率

Fig.4 用2A连接2个基因可以从一个转录本生成两个单独的多肽