暗场显微镜是一种用于增强未染色、透明样品对比度的照明技术。 通过斜照明阻挡直射光，只允许散射、衍射或折射的光进入显微镜物镜。 让样本会以明亮的形态显示在暗背景上。

如此高的对比度可以轻松显现背景复杂的样本，是观察正常照明条件下成像不佳的样本的理想工具。

暗场显微镜通过阻挡中心光线，让斜照明照亮样品来实现。 由于聚光镜中的不透明光阑可以阻挡直射光，只允许散射、衍射或折射的光进入物镜，从而明亮暗背景的样本。

详细工作过程如下：

• 阻挡中心光： 用一个不透明的挡光片阻挡直接穿过或绕过标本的光线。
• 斜照明： 简单的阿贝暗场聚光镜的上透镜是球面凹透镜。 可使表面射出的光线形成一个倒置的空心光锥，聚焦于样本平面。
• 散射光进入物镜： 当样本被放置在载玻片上时，斜射光线与其相互作用。 样本中的成分（如细胞膜或内部细胞器）会使光线发生衍射、反射和折射，从而进入物镜。
• 暗场背景： 在没有样本的区域，斜射光线相互交叉并完全错过物镜，使这些区域完全黑暗。

暗场显微镜主要用于观察常规明场成像对比度不足的透明或未染色标本。 它对于观察轮廓、边缘、边界和折射率梯度非常有效。

常见应用包括：

• 生物样本： 活体水生生物、细菌、酵母、原生动物、组织培养细胞。
• 结构细节： 边缘、边界和表面特征，如毛发和纤维。
• 非生物标本： 矿物和化学晶体、胶体颗粒、粉尘计数标本、含有微小夹杂物或孔隙差异的聚合物和陶瓷薄片。

一般来说，在适当的暗场照明条件下成像的物体看起来非常壮观。 下面是利用暗场成像技术拍摄的令人惊叹的一些样本示例：

暗场图像展示了蝴蝶翅膀表面起装饰作用的微小鳞屑。 用暗场台下聚光器照亮，并在低倍率 (50X) 下拍摄的翅膀上的鳞屑。

Mortimer Abramowitz 用 Evident 显微镜拍摄的 埃氏蛛形藻 的暗场图像。 样本用高数值孔径暗场聚光器照明，并在载玻片与物镜及聚光器前透镜之间放置浸油。

I液态晶体 DNA 的暗场图像。 高浓度 DNA 溶液经过一系列液态晶体相变，形成致密堆积的六方相。 使用配备 10X 物镜的复合光学显微镜拍摄。

使用 GX53 金相显微镜拍摄的抛光铝硅合金的暗场图像。

了解暗场显微镜与明场显微镜的区别，有助于为样本选择合适的观测方法。 简要对比指南如下：

虽然暗场照明可以产生壮观的图像，但了解它的优缺点也很重要。

• 对比度高： 具有很高的对比度，能够在不易观察的背景下轻松观察到样本。
• 最适合观察对比度低的透明样本： 非常适合观察在明场下不易看到的样本。
• 极少染色： 无需复杂的染色程序即可观察样本。
• 适用于活体标本： 由于无需染色，可以直接观察自然状态下的活体水生生物及细胞。
• 图像视觉效果突出： 生成的图像往往看起来像艺术品。

• 内部细节有限： 显示样本内部细节的效果有限。
• 对碎屑和污染物敏感： 可以照亮载玻片上的每一粒灰尘或碎屑，导致降低图像质量。
• 需要校准： 聚光镜必须精确校准和聚焦，以避免视野中心出现光线不均匀或暗点。
• 可能较暗： 由于照明锥的大部分光线被阻挡，因此需要大量的光线。
• 物镜限制： 并非所有物镜都适用，尤其是在使用数值孔径（NA）不够高的聚光镜插件时。

不需要，暗场显微镜通常不需要染色。 暗场显微镜特别适合观察在正常明场条件下难以看到的透明、未染色或低对比度样本。 事实上，避免染色可以让研究人员观察活体样本，例如水生生物和细胞培养物，而不会改变它们的自然状态。 不过染色样本（如椴木切片）也可以成为优秀的观察对象，能够产生绚烂多彩的图像。

椴木薄切片染色后的暗场图像。

几乎任何明场实验室显微镜都可以轻松改装，实现暗场照明。 基本设备包括：

• 明场显微镜兼容性：能够安装暗场组件的标准实验室显微镜。 
• 暗场聚光镜或光阑/插入件：专用暗场聚光镜可提供所需的高数值孔径。 聚光镜插入件也可以产生必要的照明锥，为多种观察方法提供灵活性。
• 物镜兼容性：物镜必须与聚光镜的数值孔径相匹配。
• 光源： 需要强光源来补偿被遮挡的中心光线。
• 聚光镜校准工具： 聚光镜需要居中才能确保照明均匀。
• 洁净的载玻片和光学元件： 载玻片必须保持洁净，因为任何碎屑都会散射光线并降低图像质量。

设置显微镜进行暗场成像是一个很简单的过程。 请按照以下步骤操作以获得最佳效果：

1. 安装暗场聚光镜或暗场光阑： 将当前聚光镜更换为暗场聚光镜，或在现有的兼容聚光镜中插入暗场光阑。
2. 放置并准备样本： 确保载玻片和盖玻片保持洁净，然后将样本放在载物台上。
3. 对准并聚焦聚光镜： 将聚光镜对中并正确聚焦。 如果看到视场中心出现黑点，则可能是聚光镜未对准。
4. 使用兼容的物镜： 选择适用于暗场聚光镜的、数值孔径适当的物镜。
5. 增加照明： 调高光源的功率。 由于阻挡了中心光线，暗场照明需要的光要比明场照明多。 注： 请注意，活体样本可能对长时间强光照射较为敏感。

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