什么是活体成像

活体成像指在活体状态下在细胞和分子水平上应用影像学方法对生物过程和时间上的定性和定量分析的一门科学，主要包括生物发光与荧光、同位素成像、X光成像等。其中，生物发光是荧光素酶基因标记细胞，而荧光技术则采用荧光报告基团表达的荧光蛋白、荧光染料等进行标记，然后利用仪器进行检测。通过活体成像技术可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程，其中以生物发光应用较为实用。

按成像原理分类

 光学成像是目前最主流、应用最广的技术，尤其适合在细胞和分子水平进行研究。主要分为生物发光和荧光成像两类以及其他体内成像。
 

按研究对象分类

活体成像技术的应用范围非常广，研究对象也多种多样：

1、模型动物：如小鼠、大鼠、斑马鱼等，是疾病模型和药物筛选中最常用的对象。

2、植物：如拟南芥、烟草等，用于植物研究在干旱、盐胁迫等条件下的生理反应和病原侵染过程。

3、细胞和组织：虽然不完全是"活体"，但离体的组织活细胞样本也可以用类似技术进行成像分析。

按检测内容分类

根据研究目的，活体成像可以检测不同的生物学实验：

1、基因表达与蛋白激活：观察特定基因在何时何地被激活。

2、细胞行为：追踪细胞的迁移、增殖、凋亡和分布。

3、疾病进展：监测肿瘤的生长与转移、炎症感染灶的扩散等。

4、药物响应：评估药物或治疗方案的效果，通过纵向观察一只动物，减少个体差异。

核心应用方向

无论采用哪种技术，活体成像的核心价值在于能够在不伤害动物的前提下，对同一个体进行长期、动态的观测，从而将看不见的生命过程转化为可视化的数据。

1、肿瘤研究：实时监测肿瘤细胞的增殖、转移和药物响应。

2、药物研发：追踪药物在体内的分布、代谢过程及靶向效果。

3、感染与免疫：观察细菌或病毒在体内的扩散，以及免疫细胞的迁移和应答。

4、基因表达分析：研究特定基因在何时、何地被激活。

实验怎么选？

1、追求超高灵敏度和定量：选生物发光（BLI），背景干净，信号稳定，适合长期监测。

2、需要多靶点或高分辨率：选荧光成像（FLI），标记灵活，可多色成像，能看清结构细节。

3、要看精细解剖结构：选 MRI或CT，能清晰呈现器官和组织形态。

 

生物发光成像底物如何选择？

主流选择：D-荧光素

D-荧光素（D-Luciferin）是萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）系统的专用底物，也是目前活体成像中最主流的选择。

优点：它发出的光波长在540-600nm，属于偏红光，在生物组织中的穿透性更好，信噪比高。信号稳定，特异性好，非常适合用于肿瘤生长、药物疗效评估等需要长期动态监测的实验。

适用场景：绝大多数基于Luc报告基因的活体成像实验，如肿瘤模型、干细胞示踪、感染性疾病研究等。

其他常见底物：
除了D-荧光素，根据你使用的荧光素酶不同，还有其他选择。

（1）腔肠素（Coelenterazine）：这是海肾荧光素酶（Renilla Luciferase）的底物。它的发光波长较短（460-540nm），在体内代谢快，信号持续时间短，通常用于双报告基因实验或 BRET 研究。

（2）Furimazine：这是一种新型底物，与 NanoLuc 荧光素酶联用。它的亮度极高，信号持续时间长，灵敏度远超传统底物，非常适合用于检测低丰度靶点或需要高灵敏度的场景。

实验避坑小贴士

溶解缓冲液：配制D-荧光素溶液时，最好用不含钙镁离子的 PBS（如 DPBS），因为这些离子可能会抑制荧光素酶的活性。

给药与成像时间：腹腔注射底物后，通常需要等待10-15分钟让信号达到峰值平台期再进行成像。整个稳定发光窗口大约持续30-45分钟，要合理安排操作时间。

体外验证：在进行昂贵的动物实验前，务必先在体外验证你的细胞是否稳定表达荧光素酶，并确认发光强度与细胞数量呈良好的线性关系，这能避免后续实验走弯路。

选底物核心三原则

1. 先看酶：你的细胞/动物表达什么酶，就选对应的底物，这是铁律。

2. 再看应用：追求超高灵敏度可考虑 NanoLuc/Furimazine 系统；常规肿瘤、干细胞追踪用经典的 Firefly Luc/D-荧光素系统完全足够。

3. 最后看形式：体内实验优选 D-荧光素钾盐，溶解方便，性能稳定。

实验新手指南

常规实验：直接用D-荧光素钾盐，这是最稳妥、最通用的选择。

双标/特殊研究：根据你使用的荧光素酶选择对应的腔肠素或Furimazine。

关键一步：无论选哪种，都建议在正式实验前做预实验，确定最佳的底物浓度和成像时间点。

核心选品三大原则

1. 穿透深度优先：优先选择近红外 NIR-I（700–900 nm）和 NIR-II（900–1700 nm）波段，避开可见光（蓝/绿/红），因为后者在皮下/体内的穿透能力极差。

2. 体内低自发荧光：小鼠皮肤、血液、内脏在 500–650 nm 波段的自身荧光极强，应尽量少用绿色和橙色荧光染料。

3. 生物安全 + 体内滞留：要求染料低毒性、不易代谢猝灭、无免疫原性，同时适配静脉、腹腔或局部给药等不同途径。

按波长分区选型（活体优先级）

可见光区

1. 绿色（FITC、Calcein、GFP）：仅适用于体表浅层成像，体内极易被血红蛋白吸收，深部组织无法观测。

2. 红色（Cy5、Cy5.5）：浅层可用，但在腹部和胸腔成像时背景信号较高。

• 近红外一区（NIR-I）：体内成像黄金波段，穿透深、仪器通用。

1. ICG（吲哚菁绿）

Ex/Em：780/810 nm

优点：临床获批、体内毒性极低，是血管/淋巴/肿瘤示踪的首选。

用途：活体血管成像、淋巴引流、肿瘤富集、脏器灌注。  缺点：光稳定性一般，易快速代谢。

2. Cy7 / Cy7.5

Ex/Em：750/780 nm（Cy7）、788/820 nm（Cy7.5）

优点：荧光亮度高、修饰方便，可标记蛋白/多肽/药物。

用途：活体靶向肿瘤成像、药物体内示踪、细胞活体示踪。

3. DiR（细胞膜亲脂染料）

Ex/Em：750/780 nm

用途：活体干细胞/免疫细胞的体内追踪，标记活细胞并观察其体内迁徙与定植。

• 近红外二区（NIR-II）：穿透最深、背景最低，适合深部肿瘤、脑部和内脏成像。

代表染料：IR-1061、H₂O₂ 探针、NIR-II 量子点

优势：皮下 >5 mm 组织可清晰成像，几乎无动物自发荧光干扰。

适用：深部实体瘤、脑部原位瘤、深层脏器示踪。

实验新手速选口诀

浅层观察用 Cy5.5，体内深部选 Cy7；
细胞追踪靠 DiR，血管淋巴用 ICG；
追求超清深组织，直接上 NIR-II；
绿光红光别入体，自发荧光全干扰。

部分参考文献：

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