磷酸化蛋白的 Western Blot 实验反反复复却怎么都得不到理想条带？信号弱弱弱弱到怀疑人生?蛋白磷酸化——可逆性的翻译后修饰，细胞裂解后的每一分钟，都可能导致磷酸化水平发生变化......

Section.01
实验开始之前：你需要知道...

蛋白质磷酸化 (Protein Phosphorylation) 是真核细胞中最重要、研究最广泛的翻译后修饰之一。蛋白激酶和蛋白磷酸酶通过可逆磷酸化共同调控蛋白功能，参与细胞增殖、分化、凋亡、代谢及免疫应答等几乎所有生命活动，是细胞信号网络中的核心"开关"^[1-6]。

磷酸化通常发生于丝氨酸 (Ser)、苏氨酸 (Thr) 或酪氨酸 (Tyr) 残基，其动态变化能够快速调控蛋白的活性、构象、亚细胞定位及蛋白-蛋白相互作用。相较于检测蛋白表达量，磷酸化水平更能直接反映蛋白的功能状态及细胞内信号通路的激活程度，因此已成为细胞信号转导研究的重要指标^[6-7]。

磷酸化蛋白：如此"娇贵"？

与普通蛋白相比，磷酸化蛋白并非稳定存在，而是处于磷酸化与去磷酸化的动态平衡：激酶催化蛋白发生磷酸化，蛋白磷酸酶负责去除磷酸基团。

图 1. 蛋白质磷酸化的调控机制^[8]。

细胞被裂解后，ATP 供应迅速终止、激酶活性随之下降，而磷酸酶仍可在一定时间内保持活性，因此目标蛋白会持续发生去磷酸化，导致真实的磷酸化水平不断下降。即样品处理越慢，磷酸化水平丢失越严重。因此，快速裂解、全程低温以及及时抑制磷酸酶活性，是获得可靠磷酸化 WB 结果的关键。

需确认：目标蛋白是否存在磷酸化位点？

很多磷酸化蛋白 WB 实验失败，并非实验操作本身存在问题，而是实验设计阶段就出现了偏差。因此，在开始实验前，建议优先明确以下几个关键问题：

目标蛋白是否已报道存在磷酸化修饰？
已鉴定的磷酸化位点有哪些 (Ser、Thr 或 Tyr)？
哪个位点具有明确的生物学意义？
同类研究通常检测哪个磷酸化位点？
是否已有成熟 WB 验证方案？

建议优先查询 PhosphoSitePlus、UniProt (PTM / Processing)、NCBI / PubMed 等数据库，快速获取信息：已报道的磷酸化位点、对应的上游激酶及调控机制、是否已有商业化磷酸化抗体？是否已有文献采用 WB 进行验证？完成位点确后，再选择相应的磷酸化抗体，能够大幅降低后续试错成本。

Section.02
磷酸化蛋白：样品制备

裂解液：冰上操作，新鲜配制

裂解液的选择原则非常简单：裂解速度越快，磷酸化状态保留越完整。

建议全程在冰上操作，并尽可能缩短裂解时间。裂解完成后应立即离心，尽快开展后续实验；样品避免长时间室温放置，以减少磷酸化水平的丢失。

MCE 细胞裂解液推荐：

蛋白提取：添加双重抑制剂

很多实验室已经习惯在裂解液中加入蛋白酶抑制剂，以防止蛋白降解。但对于磷酸化蛋白来说，仅加入蛋白酶抑制剂远远不够，还必须加入磷酸酶抑制剂 ，在细胞裂解瞬间抑制磷酸酶活性，尽可能保留蛋白原有磷酸化状态。

常见的磷酸酶抑制剂包括：

酪氨酸磷酸酶(PTP) 抑制剂：Sodium Orthovanadate (Na₃VO₄)等；

丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 (PP1、PP2A、PP2B 等) 抑制剂：Okadaic Acid、Sodium Fluoride (NaF) 、β-Glycerophosphate、Sodium Pyrophosphate 等。

实际实验中，更推荐使用蛋白酶抑制剂和广谱磷酸酶抑制剂 Cocktail，可同时抑制多种蛋白酶和磷酸酶，提高实验重复性。

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磷酸化蛋白：电泳

双内参：传统内参+总蛋白内参

完整的磷酸化 WB 通常包含三类蛋白：

磷酸化蛋白 (Phospho Protein)；

总蛋白 (Total Protein)：用于评价目标蛋白表达量是否发生变化；

内参蛋白 (Loading Control)：用于验证各泳道上样量是否一致，如 GAPDH、β-actin、Tubulin 或 HSP90。

这样既可以评价蛋白表达变化，也能够准确反映磷酸化水平。

为什么建议同时检测 Total Protein？

磷酸化蛋白 WB 反映的是蛋白磷酸化状态，而不是蛋白表达量。如果目标蛋白本身表达发生变化，仅检测磷酸化蛋白，很容易将表达量变化误判为磷酸化水平变化。

因此，在数据分析中，Phospho/Total Protein 比值通常比单独比较磷酸化条带更能反映蛋白活化程度，也是普遍采用的数据分析方式。

增加上样量！

在大多数情况下，磷酸化蛋白通常仅占目标蛋白的一小部分。如 Total AKT 表达量通常较高，而 p-AKT (Ser473) 仅占其中很小一部分，因此磷酸化蛋白的检测信号往往明显弱于 Total Protein。可适当增加上样量 (在蛋白胶容量允许范围内)，有助于提高检测灵敏度。

对于磷酸化蛋白的检测，没有一个固定的标准数值，通常建议将总蛋白上样量提高至 50-100 μg/泳道。

同时，上样量并非越高越好，超过 100 μg 可能会导致蛋白条带拖尾、转膜效率下降或背景升高，反而影响结果。

可根据文献实验方案和试剂供应商的建议摸索自己的实验上样量。

此外，应保持各泳道上样量一致，并根据目标蛋白分子量合理选择凝胶浓度，以获得最佳分离效果。

转膜：避免磷酸化蛋白损失

磷酸化蛋白与普通蛋白的转膜条件基本一致，但仍需根据蛋白分子量优化转膜时间和电流，避免转膜不足或过度转膜，以及 PVDF 膜使用前需充分活化。

对于低丰度磷酸化蛋白，建议转膜后先进行通过 Ponceau S 染色，以确认蛋白是否均匀、完整地转移至膜上，再进行封闭和抗体孵育。

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磷酸化蛋白：封闭

封闭液：5% BSA

很多实验室习惯使用 5% 脱脂奶粉封闭。但对于磷酸化蛋白检测，并不是最佳选择。原因在于奶粉中富含 Casein (酪蛋白)，而酪蛋白本身属于高度磷酸化蛋白。可能与部分磷酸化抗体发生非特异性结合，导致背景升高、信噪比下降。

因此，对于绝大多数磷酸化抗体，更推荐采用 5% BSA (牛血清白蛋白) 进行封闭，以获得更稳定、更可靠的检测结果。

洗涤液：TBST 溶液

建议优先使用 TBST(TBS + Tween-20) 洗膜。虽然 PBS 在多数情况下也可使用，但由于其含有磷酸盐缓冲体系，部分磷酸化抗体可能受到一定影响，因此多数文献更推荐采用 TBST。

此外，洗膜并非越久越好，对于低丰度磷酸化蛋白，过度洗膜反而可能降低目标信号。

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磷酸化蛋白：抗体

磷酸化抗体是关键

选择磷酸化抗体时，关注的不仅是目标蛋白，更重要的是目标磷酸化位点。

例如，AKT 常用的 WB 抗体包括 p-AKT (Ser473) 和 p-AKT (Thr308)。两者分别识别不同磷酸化位点，在不同刺激条件下，其变化趋势可能并不一致。

因此，建议结合文献和数据库，重点确认以下信息：

是否为位点特异性抗体 (Ser、Thr 或 Tyr)；

位点编号是否与研究目标一致；

是否经过 WB 应用验证；

是否提供阳性对照数据；

是否具有高质量文献引用。

优先选择经过大量文献验证的抗体，可有效提高实验成功率和结果可信度。

针对磷酸化蛋白检测过程中常见的样品降解、去磷酸化及实验重复性差等问题，MCE 也可提供覆盖实验全流程的产品解决方案，帮助科研人员从样品制备到信号检测，全流程降低磷酸化丢失风险，提升实验稳定性和数据重复性。

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案例解读

Lenvatinib 是晚期肝细胞癌 (HCC) 的一线靶向治疗药物，但临床上部分患者会逐渐产生耐药。研究人员通过 CRISPR 基因组筛选发现，EGFR、PAK2 和 ERK5 是影响 Lenvatinib 疗效的重要基因，因此进一步利用磷酸化 Western Blot 对 EGFR-PAK2-ERK5 信号通路进行了验证^[9]。

磷酸化蛋白：p-EGFR、p-PAK2、p-ERK5、p-MEK、p-ERK，反映蛋白是否被激活；

总蛋白：t-EGFR、t-PAK2、t-ERK5、t-MEK、t-ERK，判断目标蛋白的表达量是否发生变化；

内参：HSP90 作为内参，在不同处理组中的表达量基本一致，说明各泳道总蛋白上样量一致，保证了不同处理组质检具有可比性。

如图 2 可得：

Lenvatinib 抑制了经典 MAPK 通路中 ERK1/2 的磷酸化活化 (p-ERK↓)，但 Total ERK 基本保持不变。

同时，Lenvatinib 诱导 EGFR–PAK2–ERK5 信号发生反馈激活，表现为 p-EGFR、p-PAK2 和 p-ERK5 水平均升高，而对应的 Total Protein 无明显变化。

联合 EGFR 抑制剂 (Gefitinib 或 Erlotinib) 后，上述反馈激活被有效阻断，并进一步增强了对下游 MEK/ERK 信号的抑制作用。

此外，结合文章中 CRISPR 筛选和功能实验结果，研究人员认为 EGFR–PAK2–ERK5 信号通路的反馈激活是限制 Lenvatinib 治疗肝细胞癌疗效的重要耐药机制。

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小结

磷酸化蛋白 WB 难做，并不是因为技术复杂，而是因为每一个细节都会影响最终结果。真正决定实验成功率的，往往不是最后的显影，而是在样品裂解后的前几分钟。把握好：位点选择—快速裂解—抑制去磷酸化—规范 WB 操作四个关键环节，才能更真实地反映蛋白在细胞中的磷酸化状态，为信号通路研究提供可靠的数据支持。

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参考文献

[1] Cell Signaling. Cell Signaling, 7th ed. Wiley-Blackwell.
[2] Hunter T. Protein kinases and phosphatases: the yin and yang of protein phosphorylation and signaling. Cell. 1995 Jan 27;80(2):225-36.
[3] Hunter T. Signaling--2000 and beyond. Cell. 2000 Jan 7;100(1):113-27.
[4] Cohen P. Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century? Nat Rev Drug Discov. 2002 Apr;1(4):309-15.
[5] Fabbro D, et al. PKC412--a protein kinase inhibitor with a broad therapeutic potential. Anticancer Drug Des. 2000 Feb;15(1):17-28.
[6] Molecular Biology of the Cell. Alberts B, et al. Garland Science, 2022.
[7] Cohen P. The origins of protein phosphorylation. Nat Cell Biol. 2002 May;4(5):E127-30. doi: 10.1038/ncb0502-e127. PMID: 11988757.
[8] Florian Plattner, James A. Bibb, Chapter 25 - Serine and Threonine Phosphorylation, Editor(s): Scott T. Brady, George J. Siegel, R. Wayne Albers, Donald L. Price, Basic Neurochemistry (Eighth Edition), Academic Press, 2012, Pages 467-492, ISBN 9780123749475,
[9] Jin H, et al. EGFR activation limits the response of liver cancer to lenvatinib. Nature. 2021 Jul;595(7869):730-734.