OLYMPUS CKX53 倒置显微镜荧光升级及 活/死细胞双色荧光染色（AO/PI 法）检测应用方案 🏷️ 标签：CKX-UVBG-E 模块 | AO/PI 双染 | 显微成像升级

📌 本文快捷目录与摘要导读 (Table of Contents)   • 1. 方案背景与 AO/PI 双色荧光检测原理（特异性标记与抗干扰能力）   • 2. CKX53 荧光升级硬件组件（CKX-UVBG-E 电动模块及 4 大核心优势）   • 3. AO/PI 双色荧光检测 5 步标准化实施流程指南   • 4. 实拍图像成果与双通道数据评估比对   • 5. 规范操作注意事项与设备保养建议

SECTION 01  |  方案背景与 AO/PI 双色荧光检测原理

在细胞生物学、组织工程、肿瘤学评估及原代细胞提取过程中，精准鉴别细胞存活状态是核心检测步骤。吖啶橙（Acridine Orange, AO）与碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）联合使用的双色荧光染色法，能够特异性标记质膜完整性。相较于传统台盼蓝明场染色，AO/PI 双色荧光法能够有效排除原代样品中的无核红细胞、细胞碎片及杂质干扰，展现出高的检测特异度与识别准确率。
 

荧光探针	膜穿透特性	胞内分子靶点与反应机制	激发/发射光谱及适配通道
吖啶橙 (Acridine Orange, AO) [ 绿色荧光通道 ]	膜透过型 (脂溶性)	能够自由穿透膜结构完整的活细胞与死细胞质膜，与双链 DNA 嵌合结合发出强绿色荧光	Ex: 470/35 nm / Em: 525/45 nm (匹配 B 激发组 / FITC)
碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) [ 红色荧光通道 ]	非膜透过型 (仅透过受损膜)	无法穿越膜结构完整的活细胞质膜；仅当细胞死亡质膜破损时穿入胞内，与双链 DNA 嵌合发出红色荧光（产生 FRET 掩盖/吸收绿光）	Ex: 545/25 nm / Em: 605/65 nm (匹配 G 激发组 / TRITC)

SECTION 02  |  CKX53 倒置显微镜荧光升级方案（CKX-UVBG-E 模块）

     

CKX-UVBG-E 模块升级 4 大核心优势 • 多片透镜高效聚光系统：提供高强度且分布均匀的激发光斑，高品质带通滤光片确保独立通道荧光纯净明亮。 • 丰富通道选配：标配 UV（DAPI）、B（FITC/GFP）、G（TRITC/CY3）三色组，并可选配 Y（mCherry）、R（CY5）等，满足多样化需求。 • 低风噪主动循环散热：内置低风噪风扇进行主动循环风散热，有效保障 LED 灯珠与滤光片的温度稳定，防止光谱中心波峰漂移。 • 软件联动扩展：支持外部协议通讯与软件联动控制，可无缝对接电脑端的图像采集与分析软件。

SECTION 03  |  AO/PI 双色荧光检测标准解决方案流程

STEP 01  |  试剂准备与细胞样品洗涤	工作液配制：使用无荧光背景的 PBS 缓冲液将 AO 与 PI 母液稀释成双染色工作液（推荐终浓度：AO 约 5–10 μg/mL，PI 约 10–20 μg/mL），现配现用并避光保存。 样品洗涤：取待测贴壁或悬浮细胞，用温育的 PBS 轻轻洗涤 1–2 次，消除培养基成分及残余血清对荧光染色的干扰。
STEP 02  |  样品混合染色与短时温育	染色混合：将 AO/PI 混合工作液与细胞悬液按 1:1 比例充分混合（或直接加至细胞培养孔中），使染色液均匀覆盖细胞。 避光温育：室温避光孵育 5–10 分钟。由于 AO/PI 与核酸结合迅速，建议在 20 分钟内完成上样与图像采集。
STEP 03  |  CKX53 上样与明场/相衬快速定位	放置样品：将染色后的血球计数板或培养皿置于 CKX53 载物台上，使用 Universal Holder 固定。 相衬寻焦：开启 LED 明场光源，利用 iPC 整合相衬系统（4X–40X 切换无需换相衬环）快速寻找代表性视野并完成对焦。
STEP 04  |  电动智能荧光通道切换与采集	B 通道采集（活细胞）：通过 CKX-UVBG-E 单指按键一键切换至 B 激发通道（FITC），LED 光源开启，采集绿色胞质/胞核荧光图像（绿光细胞为活细胞）。 G 通道采集（死细胞）：按下按键快速切换至 G 激发通道（TRITC），智能还原预设红光功率，采集红色胞核荧光图像（红光细胞为死细胞/膜受损细胞）。
STEP 05  |  图像合成与细胞存活率定量评估	图像传输与叠加：通过相机接口将图像传输至电脑，利用配套分析软件对 FITC 绿光通道与 TRITC 红光通道进行 Overlay/Merge 通道叠加。 存活率计算：分别统计视野内的绿光活细胞数（Live）与红光死细胞数（Dead），计算细胞存活率：Vitality (%) = [Live / (Live + Dead)] × 100%。

SECTION 04  |  典型图像结果与数据评估

观察模式/通道	标本荧光形态特征	CKX53 升级后成像优势
B 激发通道 (FITC) (Ex 470/35nm)	活细胞 质膜完整，胞质/胞核呈亮绿色荧光	大功率 LED 高效聚光，全视野激发均匀；独立带通滤光片使绿光纯洁无杂光。
G 激发通道 (TRITC) (Ex 545/25nm)	死细胞 / 膜受损细胞 质膜破损，胞核呈现显著红色荧光	光强记忆功能确保切换无延迟，高截止滤光片有效抑制背景自发荧光，死细胞红核边界清晰。
双通道 Fusion 叠加 / 相衬 Overlay	综合存活率评估 准确区分活细胞、死细胞及无核碎片	电动切换顺畅，多通道叠加无焦平面与位置偏离；图像高信噪比为精准计数提供依据。

SECTION 05  |  规范操作注意事项与设备保养建议

 [ FAQ / TIPS 01 | 染色观察时间控制 ]  AO/PI 与核酸结合迅速，染色混合后建议在 20 分钟内完成观察。时间过长可能导致 AO 浓度游离变化或 PI 被活细胞少量吞噬造成假阳性。
[ FAQ / TIPS 02 | LED 激发强度适度调控 ]  充分利用 CKX-UVBG-E 模块的无级调光与光强记忆功能，在拍摄对比度满足的前提下适当调低激发功率，减缓荧光探针淬灭。
[ FAQ / TIPS 03 | 风扇风道防堵与清洁 ]  保证荧光模块侧面主动散热风扇的风道通畅，避免遮挡，定期用干燥气吹清理风扇网罩灰尘。
[ FAQ / TIPS 04 | 镜片与部件擦拭维护 ]  若载物台或物镜沾染培养基或染色液，应及时用 75% 乙醇湿润无尘纸轻轻擦拭，保持优良的透光性能与设备卫生。