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LF200倒置荧光显微镜辅助CCK-8细胞活力检测标准操作程序与注意事项

2026-09-01     来源:本站     点击次数:139

LF200倒置荧光显微镜辅助CCK-8细胞活力检测
 

图1  LF200倒置荧光显微镜（电动荧光版）
 
1  目的
规范LF200倒置荧光显微镜辅助CCK-8细胞活力检测的操作流程，确保实验操作的标准化、可重复性和结果可靠性。通过将酶标仪比色定量与显微镜原位形态学观察相结合，全面评估细胞活力状态，避免单一OD值检测可能导致的结果误判。

2  范围
本规程适用于以下实验场景：
  • 药物细胞毒性筛选与评价（包括抗肿瘤药物、化合物、天然产物提取物等）
  • 细胞增殖动力学检测与生长曲线绘制
  • 细胞因子、生长因子生物活性测定
  •  biomaterial生物相容性评价
  • 其他需要评估细胞活力/增殖状态的体外细胞实验
适用细胞类型：贴壁生长的哺乳动物细胞（如肿瘤细胞系、正常细胞系、原代细胞等）。悬浮细胞需先离心收集后再进行检测，操作流程可参照本规程适当调整。

3  术语与定义
 
术语 定义
CCK-8 Cell Counting Kit-8，一种基于WST-8的细胞活力检测试剂，活细胞线粒体脱氢酶将其还原为橙黄色甲瓒产物，OD值与活细胞数成正比。
相差显微镜 利用光的衍射和干涉原理，将活细胞不同结构间的相位差转换为振幅差（明暗差），从而在无需染色的情况下观察透明活细胞的显微镜技术。
倒置显微镜 物镜位于载物台下方、光源与聚光镜位于载物台上方的显微镜，适合观察培养瓶/培养板内的贴壁活细胞。
AO-PI染色 吖啶橙（AO）-碘化丙啶（PI）双荧光染色法，AO可透过活细胞膜染绿色，PI仅能透过死细胞膜染红色，用于区分活细胞与死细胞。
IC50 半数抑制浓度，指药物抑制50%细胞活力时的浓度，是评价药物细胞毒性的重要参数。
OD值 光密度值（Optical Density），酶标仪测定的吸光度值，CCK-8检测中测定波长为450 nm。
 
4  设备与试剂
4.1  主要设备
 
设备名称 规格/配置要求 用途
LF200倒置荧光显微镜 WF10X/22mm大视野目镜；10×/20×/40×长工作距离相衬物镜；转盘式相差环；电动5通道LED荧光激发盒（DAPI/FITC/TRITC）；C-MOUNT成像接口；显微相机 细胞原位形态学观察、相差成像、荧光成像
酶标仪 具备450 nm检测波长、600-650 nm参考波长 CCK-8比色定量测定
CO₂培养箱 37℃、5% CO₂、饱和湿度 细胞培养与CCK-8孵育
超净工作台 百级洁净度 无菌操作
低速离心机 最大转速5000 rpm 细胞收集
系列移液枪 0.5-10 μL、10-100 μL、100-1000 μL 精准加样
 
图2  LF200长工作距离平场消色差物镜系列（4×/10×/20×/40×/60×）
 
4.2  主要试剂与耗材
  • CCK-8试剂盒（2-8℃避光保存，有效期内使用）
  • 待测细胞、完全培养基（含10%胎牛血清、1%双抗）
  • 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液
  • PBS缓冲液（pH 7.2-7.4）
  • 受试药物（用合适溶剂配制，DMSO终浓度≤0.1%）
  • 可选：AO-PI活死细胞染色试剂盒
  • 96孔细胞培养板、无菌吸头、细胞培养皿
5  操作前准备
5.1  设备状态确认
实验前30 min完成以下设备检查，确认设备处于正常可用状态：
  1. LF200显微镜检查：开启主机电源，确认透射LED光源正常点亮；转动物镜转盘确认各倍率切换顺畅；旋转相差转盘确认各档位卡位清晰；开启电动荧光激发盒确认显示屏正常、各通道切换正常；检查目镜与物镜镜头清洁无污渍。
  2. 酶标仪检查：开机预热15 min，确认光源与检测器正常，进行空白孔校零。
  3. 培养箱检查：确认温度37±0.5℃、CO₂浓度5±0.5%、湿度正常，水盘内无菌蒸馏水充足。
  4. 超净台检查：提前30 min开启紫外灯消毒，使用前关闭紫外灯、开启风机，用75%乙醇擦拭台面。

图3  LF200载物台及培养容器托板（矩形托板适配96孔板，圆形托板适配培养皿）
 
5.2  试剂准备
  1. CCK-8试剂：从冰箱取出，室温避光平衡30 min后方可使用（避免温差导致冷凝水进入试剂）。
  2. 培养基与PBS：37℃水浴预热。
  3. 受试药物：用完全培养基稀释至所需工作浓度，现配现用。
  4. 如进行AO-PI荧光复染，按说明书配制AO-PI工作液（AO 5 μg/mL + PI 5 μg/mL，用PBS稀释），避光保存，现配现用。
5.3  细胞准备
取对数生长期细胞（汇合度70%-80%，活率≥95%），0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，台盼蓝染色计数活细胞率，调整细胞密度至接种所需浓度。

6  标准操作程序
6.1  细胞接种与培养
  1. 将调整好密度的细胞悬液充分混匀，按每孔100 μL接种于96孔板，设置空白对照组（仅加培养基）、正常对照组、溶剂对照组及各给药组，每组设3-5个复孔。
  2. 接种后将培养板在桌面上做十字形轻轻晃动3-5次，使细胞均匀分布，室温静置15-20 min后移入培养箱。
  3. 37℃、5% CO₂培养24 h，使细胞贴壁并进入对数生长期。
质量控制点：接种后用LF200显微镜10×相差物镜快速检查各孔细胞密度与分布均匀性，标记异常孔。

6.2  给药处理
  1. 从培养箱取出96孔板，在超净台内吸去各孔旧培养基。
  2. 按实验设计加入含不同浓度受试药物的完全培养基，每孔100 μL。空白对照组与正常对照组加入不含药物的完全培养基，溶剂对照组加入含相应浓度溶剂的完全培养基。
  3. 加药后轻轻敲击培养板侧壁混匀，放回培养箱继续培养设定时间（如24 h、48 h、72 h）。
6.3  给药后形态学观察与拍照（关键步骤）
在加入CCK-8之前，使用LF200倒置荧光显微镜对各孔细胞进行形态学观察与图像采集，记录给药后细胞状态。

6.3.1  明场观察
  1. 将96孔板置于LF200载物台，安装96孔板专用矩形托板。
  2. 开启透射LED明场光源，亮度调至50%-60%。
  3. 物镜转盘转至10×物镜，粗调+微调获得清晰图像，逐孔观察细胞整体分布、贴壁状态及有无污染、气泡。
6.3.2  相差观察与拍照
  1. 物镜转盘转至10×相差物镜（物镜标识含「PH」字样）。
  2. 旋转聚光镜相差转盘，将「10」档位旋入光路（听到卡位声），确保相差环倍率与物镜倍率一致。


图4  LF200转盘式相差环（图示为10×相差环对位状态）
  1. 微调焦距获得高对比度相差图像，观察细胞轮廓、细胞核、细胞间隙、凋亡形态（细胞皱缩、变圆、出泡、凋亡小体）等。
  2. 每孔随机选取3个代表性视野，使用C-MOUNT接口相机采集图像，统一曝光参数（光源亮度、曝光时间、增益），文件命名格式：「浓度_孔号_视野号_日期.tif」。
 

图5  LF200相差模式下活细胞成像效果（无需染色即可清晰观察细胞轮廓与内部结构）

6.3.3  高倍镜详细观察（可选）
  1. 如需观察细胞凋亡细节，转至20×或40×相差物镜，注意高倍镜工作距离较短，仅用微调手轮缓慢对焦，避免镜头触碰培养板。
  2. 高倍镜下重点观察：细胞核固缩/碎裂、细胞膜起泡、凋亡小体形成、细胞碎片等形态学特征。


图6  LF200五孔内定位物镜转盘（后倾斜设计，滚珠定位，切换精准顺畅）
 
6.4  CCK-8检测
  1. 形态学拍照完成后，将培养板移回超净台，每孔加入CCK-8溶液10 μL（培养基体积的1/10）。
  2. 加样时将枪头伸入液面下缓慢注入，避免产生气泡；如产生气泡，用无菌枪头小心戳破。
  3. 加完后轻轻敲击培养板侧壁混匀，避光放回培养箱孵育1-4 h（具体时间根据细胞类型预实验确定，以对照组OD值在1.0-2.0之间为宜）。
6.5  孵育后二次镜检
  1. CCK-8孵育结束后，取出培养板，用LF200显微镜10×明场/相差快速观察各孔。
  2. 重点确认：培养基颜色变化（橙黄色深浅与活细胞数正相关）、有无气泡、细胞是否大量漂浮脱落。
  3. 如发现异常孔（气泡、污染、细胞全部脱落），记录并在后续数据分析时标注或剔除。
6.6  酶标仪读数
  1. 将培养板静置1-2 min后放入酶标仪，测定450 nm吸光度值（OD₄₅₀），以630 nm为参考波长。
  2. 每板读取2次，取平均值。如两次读数差异>5%，检查是否有气泡或仪器故障后重新测定。
6.7  AO-PI荧光复染验证（可选）
如需进一步验证活死细胞比例，在CCK-8检测完成后进行AO-PI荧光复染：
  1. 吸去孔内培养基，PBS轻轻清洗2次（每次50 μL，避免吹打到细胞层）。
  2. 每孔加入AO-PI工作液50 μL，室温避光孵育10 min。
  3. 吸去染色液，PBS清洗1次，加入PBS 50 μL。
  4. 使用LF200电动荧光激发盒进行多通道成像：FITC通道采集AO绿色荧光（活细胞），TRITC通道采集PI红色荧光（死细胞）。
  5. 每孔随机采集5个视野，使用ImageJ软件进行活死细胞计数，计算活细胞比例。


图7  LF200多通道荧光叠加成像（AO绿色=活细胞，PI红色=死细胞）


图8  LF200 TRITC通道荧光成像（PI红色荧光标记死亡细胞细胞核）

7  数据处理与结果判定
7.1  细胞存活率计算
按以下公式计算各给药组细胞存活率：
细胞存活率（%）=（给药组OD₄₅₀ - 空白组OD₄₅₀）/（对照组OD₄₅₀ - 空白组OD₄₅₀）× 100%

7.2  IC₅₀计算
使用GraphPad Prism或Origin软件，以药物浓度对数为X轴、细胞存活率为Y轴，进行非线性回归拟合（log(inhibitor) vs. normalized response - Variable slope），计算IC₅₀值及95%置信区间。

7.3  结果判定标准
 
判定项目 合格标准 不合格处理
对照组OD值 1.0-2.5之间 OD<1.0：细胞密度过低或孵育时间不足；OD>2.5：细胞过密或孵育过久，均需调整条件重做
复孔变异系数（CV） ≤10% CV>10%：检查加样均匀性、细胞分布、有无气泡，剔除异常值后重新计算，必要时重做
空白组OD值 ≤0.15 空白OD过高：检查CCK-8试剂是否污染、培养基是否过期，更换试剂重做
溶剂对照组 与正常对照组存活率差异≤10% 差异>10%：溶剂浓度过高，降低溶剂终浓度（≤0.1%）后重做
形态学与OD值一致性 形态学观察结果与OD值趋势一致 不一致：排查细胞聚集、碎片干扰、污染等因素，结合形态学照片综合分析，必要时增加AO-PI验证
 
8  质量控制要点
  • 细胞状态控制：必须使用对数生长期、活率≥95%的细胞，避免使用传代次数过多、状态不良或刚复苏的细胞。
  • 接种密度控制：根据细胞大小和增殖速度优化接种密度，确保给药时细胞汇合度在50%-70%，避免过度融合。
  • 接种均匀性控制：接种后十字形晃动+室温静置，确保细胞均匀分布，避免边缘效应和中央聚集。
  • CCK-8孵育时间控制：预实验确定最佳孵育时间，以对照组OD值在1.0-2.0为宜，避免OD值进入非线性范围。
  • 显微镜拍照参数统一：所有孔的相差/荧光拍照使用相同的光源亮度、曝光时间和增益，确保图像间具有可比性。
  • 避光操作：CCK-8试剂和AO-PI染色液均需避光保存和使用，避免光照导致试剂失效或背景升高。
  • 无菌操作：全程在超净台内进行无菌操作，显微镜观察时尽量缩短开盖时间，减少污染风险。

图9  WF10X/22mm大视野目镜视场对比（Φ22mm vs Φ20mm vs Φ18mm），大视野有助于快速评估整孔细胞状态
 
9  异常处理
 
异常现象 可能原因 处理措施
OD值整体偏低 细胞密度不足；孵育时间短；CCK-8试剂失效；细胞状态差 提高接种密度；延长孵育时间；更换新批次CCK-8；使用状态良好的对数期细胞
OD值整体偏高 细胞过密；孵育时间过长；污染；药物本身有颜色 降低接种密度；缩短孵育时间；检查污染；设置药物空白对照扣除本底
复孔差异大 细胞分布不均；加样误差；气泡；孔边缘效应 接种后静置使细胞均匀分布；规范加样操作；清除气泡；避免使用边缘孔或边缘孔加PBS
高浓度组OD反升 药物诱导细胞聚集；细胞碎片非特异性显色；药物有颜色 显微镜下确认细胞状态；设置无细胞药物对照；选择无色药物或调零
相差图像模糊 相差环与物镜倍率不匹配；聚光镜高度不当；镜头脏 核对相差环倍率；调节聚光镜高度；清洁物镜镜头
荧光图像背景高 曝光时间过长；染料浓度过高；非特异性染色；未洗涤干净 缩短曝光时间；优化染料浓度；增加PBS洗涤次数
显微镜下发现污染 操作污染；试剂污染；培养板密封不严 立即标记隔离污染孔/板；排查污染源；更换无菌试剂；严格无菌操作
 
10  设备维护与保养
10.1  日常维护（每次使用后）
  • 关闭所有光源（透射光源、荧光光源），关闭主机电源。
  • 用干净擦镜纸轻轻擦拭目镜和物镜镜头，如有油污用擦镜纸蘸少量无水乙醇-乙醚混合液（7:3）擦拭。
  • 用干燥软布擦拭载物台表面，清除培养基残留液滴。
  • 将物镜转盘转至空位（无物镜对准通光孔），降低载物台，盖上防尘罩。
  • 填写设备使用记录（使用人、使用时间、设备状态、异常情况）。
10.2  定期维护（每月）
  • 全面清洁显微镜外表、载物台、调焦机构等部件。
  • 检查各物镜、目镜镜头清洁度，必要时进行专业清洁。
  • 检查LED光源亮度是否正常衰减，荧光激发盒各通道切换是否顺畅。
  • 检查调焦手轮松紧度，必要时调整扭矩。
10.3  年度校准（每年）
  • 由专业技术人员对光学系统进行全面校准，包括物镜分辨率、相差环对中、荧光通道激发/发射光谱验证等。
  • 检查机械部件磨损情况，必要时更换易损件。
  • 更新设备校准记录，确认设备处于合格状态。

图10  LF200超长工作距离示意（聚光镜摆出后达172mm，可兼容细胞工厂等高培养容器）

11  记录与归档
实验完成后，以下记录与数据应及时整理归档，保存期限不少于3年：
  • 实验原始记录：实验日期、操作人员、细胞信息（细胞系、代次、活率）、药物信息（名称、批号、浓度梯度）、接种密度、培养时间、CCK-8孵育时间等。
  • 酶标仪原始数据：各孔OD₄₅₀读数、仪器型号、检测参数。
  • 显微镜图像数据：各孔明场/相差/荧光图像（TIFF原始格式），包含拍摄参数（倍率、通道、曝光时间）。
  • 数据分析结果：细胞存活率计算表、剂量-反应曲线、IC₅₀值、形态学观察总结。
  • 异常情况记录：实验过程中出现的异常现象、原因分析及处理措施。
  • 设备使用记录：LF200显微镜使用登记、维护保养记录。

12  附录
附录A：96孔板布局推荐模板
推荐96孔板布局如下（以7个浓度梯度+对照组为例），边缘孔（A、H行及1、12列）加入无菌PBS以减少边缘效应：
 
  1 2 3 4 5 6 7
B PBS 对照1 对照2 对照3 浓度1-1 浓度1-2 浓度1-3
C PBS 溶剂1 溶剂2 溶剂3 浓度2-1 浓度2-2 浓度2-3
D PBS 浓度3-1 浓度3-2 浓度3-3 浓度4-1 浓度4-2 浓度4-3
E-G ...（按实验设计继续排列）            

附录B：LF200显微镜快速操作检查清单
 
序号 检查项目 合格标准 检查结果
1 主机电源 正常开启，指示灯亮 □合格 □不合格
2 透射LED光源 正常点亮，亮度可调 □合格 □不合格
3 物镜转盘 各倍率切换顺畅，卡位清晰 □合格 □不合格
4 相差转盘 各档位旋转顺畅，卡位明确 □合格 □不合格
5 调焦机构 粗调/微调操作顺畅，无卡滞 □合格 □不合格
6 载物台移动尺 X/Y方向移动顺畅，无卡滞 □合格 □不合格
7 电动荧光激发盒 显示屏正常，各通道切换正常 □合格 □不合格
8 目镜/物镜镜头 清洁无污渍、无霉斑 □合格 □不合格
9 相机与成像软件 连接正常，预览/采集功能正常 □合格 □不合格
10 托板配件 96孔板矩形托板、培养皿圆形托板齐全 □合格 □不合格
 
相关公司： 广州市莱特光电技术有限公司
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