同一份细胞样品，一台采用 AO/PI 的细胞计数仪检测结果为：总细胞数：2.36×10⁶ cells/mL；另一台采用 AO/DAPI 的细胞计数仪检测结果却是：总细胞数：2.61×10⁶ cells/mL，活率也相差了3%～8%。

到底是哪台仪器错了？

实际上，大多数情况下，两台仪器都没有”错”。真正不同的是检测原理、染料特性以及图像分析算法。

本文将从细胞生物学原理出发，系统解析 AO/PI 与 AO/DAPI 的差异，帮助科研人员正确理解检测结果。

一、AO、PI、DAPI 分别是什么？

虽然 AO/PI 和 AO/DAPI 都属于双荧光活率检测方法，但三种荧光染料的理化性质并不相同。

AO（Acridine Orange，吖啶橙）

AO 是一种核酸荧光染料。它能够自由穿过完整的细胞膜，因此：

• 活细胞可染色
• 死细胞也可染色

AO 与 DNA 结合后发出绿色荧光，与 RNA 结合时可呈现橙红色荧光，但在商业细胞计数系统中通常通过滤光片设计，仅采集绿色信号用于细胞识别。

AO 的作用只有一个：识别所有有核细胞（Total Nucleated Cells，TNC）。

因此，无论 AO/PI 还是 AO/DAPI，AO 都承担”总细胞计数”的任务。

PI（Propidium Iodide，碘化丙啶）

PI 是经典的膜完整性染料。由于 PI 分子不能穿过完整的细胞膜，因此：

• 活细胞无法染色
• 死细胞可被染成红色

PI 与 DNA 结合后产生较强的红色荧光，因此长期以来一直是流式细胞术和自动细胞计数仪中最常用的死亡细胞染料之一。

但是，PI 是否能够进入细胞，完全依赖细胞膜完整性是否已经明显破坏。

因此：早期凋亡细胞、膜完整性尚未完全丧失的细胞，有时不会被PI 检测出来。

DAPI（4’,6-diamidino-2-phenylindole）

DAPI 同样属于 DNA 荧光染料。传统实验中，DAPI 常用于固定细胞核染色。

在 AO/DAPI 自动计数体系中，则采用经过优化的检测体系，使 DAPI 用于识别膜完整性受损的死亡细胞。

其主要特点包括：

• 与 DNA 结合能力强
• 背景信号较低
• 核定位清晰
• 对核识别精度较高

因此，AO/DAPI 在许多细胞治疗质量控制平台中被广泛采用。

二、AO/PI 与 AO/DAPI 的共同点

无论采用哪种方案，其基本检测逻辑都是一致的。

因此，两者都能够输出：

• 总细胞数（Total Cell）
• 活细胞数（Live Cell）
• 死细胞数（Dead Cell）
• 活率（Viability）
• 浓度（Concentration）

真正的区别，来自于后续的细胞识别策略。

三、为什么 AO/DAPI 的总细胞数有时高于 AO/PI？

这是近年来实验室咨询最多的问题。

实际上，造成差异的原因往往不是单一因素，而是多个环节共同作用的结果。

原因一：死亡细胞识别机制存在差异

PI 与 DAPI 都属于死亡细胞染料，但二者进入细胞和结合核酸的特性不同。

对于膜完整性逐渐下降的细胞：

• 有些细胞已经允许 DAPI 进入；
• 但 PI 信号可能仍然较弱或未达到识别阈值。

因此AO/DAPI 系统可能将这些细胞判定为死亡细胞，而 AO/PI 系统则可能仍判定为活细胞或无法识别。

最终导致：

• 死细胞数增加；
• 总细胞统计方式发生变化；
• 活率略有差异。

原因二：图像识别算法不同

现代自动细胞计数仪真正的核心，并不仅仅是荧光染料。更重要的是：

图像分析软件

一套成熟算法通常包括：

• 自动聚焦
• 去背景
• 去噪声
• 核识别
• 聚团分割
• 边缘修正
• 碎片过滤

不同品牌采用完全不同的软件算法，因此即使看到的是同一张荧光图片，最终得到的细胞数量也可能不同。

原因三：聚团细胞处理方式不同

细胞治疗研究中经常遇到：

• T细胞聚团
• NK细胞聚团
• MSC聚团
• iPSC团块

对于一个细胞团，算法需要判断：它究竟包含几个细胞？

不同算法采用不同的分割模型。而 AI 分割能力越强，通常越容易识别真实细胞数量。

原因四：碎片过滤策略不同

培养后期常出现：

• 凋亡小体
• DNA碎片
• 核碎裂
• 杂质颗粒

如果过滤策略不足，这些目标容易被误认为“小细胞”，最终导致总细胞数升高。

优秀算法则能够结合：

• 荧光面积
• 核大小
• 圆度
• 亮度
• 形态参数

自动排除这些干扰。

四、哪些实验更适合 AO/PI？哪些更适合 AO/DAPI？

总体来看：

• AO/PI 已广泛应用于科研和生产检测；
• AO/DAPI 在细胞治疗、干细胞和高要求质量控制场景中应用越来越多。

需要注意的是，并不存在绝对优于另一种方法的结论，应根据实验目的、法规要求及设备平台选择合适方案。

苏州奎克泰生物的 ADAM MC2/CellT 与 ADAM MC/CellT Plus 分别基于 AO/PI 和 AO/DAPI 染色原理开发，适用于所有细胞实验质控需求，同时可选配 21 CFR Part 11 审计追踪功能，最大程度上确保企业客户数据安全性保障。

五、为什么不能直接比较两台计数仪的数据？

很多实验室喜欢今天用 A 仪器，明天换 B 仪器。然后直接比较活率是否变化。事实上这是非常危险的数据分析方式。

因为：真正发生变化的，可能不是细胞！

而是：

• 染色体系
• 判定阈值
• 图像算法
• 聚团处理方式
• 碎片过滤规则

因此如果需要长期建立实验数据库，建议始终使用同一检测平台、同一染色方法、同一分析参数。这样得到的数据才具有可追溯性和可比性。

六、如何减少不同平台之间的数据偏差？

建议实验室建立标准化细胞计数流程（SOP）：

① 样本处理标准化

• 充分吹打混匀
• 避免细胞沉降
• 控制细胞浓度

② 染色条件标准化

• 固定染料比例
• 固定孵育时间
• 固定检测时限

③ 仪器参数标准化

• 使用统一分析模板
• 定期校准仪器
• 保持相同曝光和识别参数（如设备支持）

④ 数据解释标准化

不要简单比较”数值高低”，而应结合：

• 样本类型
• 染色方法
• 仪器平台
• 算法版本
• 实验目的

总结：理解原理，比数字对比更重要

AO/PI 和 AO/DAPI 并不是相互竞争的技术，而是基于不同染料体系和算法策略发展的两种成熟方案。在多数情况下，两者都能够提供可靠的细胞数量和活率数据，但由于染料特性、膜通透性、图像识别和算法逻辑存在差异，检测结果出现一定范围内的偏差是正常现象。对于科研工作者而言，更重要的不是追求”哪一种方法数得更多”，而是：

• 了解所采用方法的检测原理；
• 建立统一、规范的实验流程；
• 在同一平台上保持数据的一致性和可比性。

只有这样，细胞计数数据才能真正成为后续培养、转染、细胞治疗和单细胞组学研究的可靠基础。

AO/PI 和 AO/DAPI 并不是相互竞争的技术，而是基于不同染料体系和算法策略发展的两种成熟方案。在多数情况下，两者都能够提供可靠的细胞数量和活率数据，但由于染料特性、膜通透性、图像识别和算法逻辑存在差异，检测结果出现一定范围内的偏差是正常现象。对于科研工作者而言，更重要的不是追求”哪一种方法数得更多”，而是：

• 了解所采用方法的检测原理；
• 建立统一、规范的实验流程；
• 在同一平台上保持数据的一致性和可比性。

只有这样，细胞计数数据才能真正成为后续培养、转染、细胞治疗和单细胞组学研究的可靠基础。