研究概述：

先天性免疫缺陷 (inborn errors of immunity, IEI) 是一类由遗传因素导致的免疫系统功能异常疾病。除感染易感性和免疫相关表现外，越来越多的IEI患者表现出神经发育迟缓、运动协调障碍、焦虑及抑郁等神经行为症状。然而，这些神经行为异常长期被认为主要来源于慢性免疫异常、疾病负担等继发因素，而IEI致病基因是否能够直接影响大脑发育及神经功能仍未被充分解析。

WHIM (Warts, Hypogammaglobulinemia, Infections, Myelokathexis) 综合征是IEI中的一种疾病，由常染色体显性Cxcr4基因突变导致。除免疫异常外，WHIM患者表现出运动协调障碍、焦虑、抑郁等神经相关表型，并在部分患者中观察到小脑叶结构异常。然而，Cxcr4异常激活如何影响小脑发育，以及这些结构异常是否进一步导致神经功能改变，仍缺乏明确机制。

意大利研究团队以WHIM综合征为研究模型，探索IEI相关神经行为异常背后的神经发育机制。团队首先通过人类脑发育基因表达数据 (BrainSpan dataset) 分析发现，IEI相关基因在人类大脑发育过程中表达于神经谱系细胞 (neural lineage) 中。团队进一步利用Cxcr4突变WHIM小鼠模型发现，在不存在免疫挑战 (immunological challenges) 的情况下，Cxcr4过度激活 (hyperactivation) 可导致小脑发育异常，包括小脑叶形成缺陷 (foliation defects) 以及浦肯野细胞 (Purkinje cells) 形态改变，并伴随感觉运动功能和行为异常，这些表型与WHIM患者中观察到的临床特征相一致。

WHIM小脑单细胞转录组分析显示，颗粒细胞祖细胞 (granule cell progenitors) 存在显著的转录调控异常 (transcriptional deregulation)，其异常增殖和迁移导致小脑叶形成缺陷以及神经回路异常。为进一步评估上述发育异常是否伴随神经网络功能改变，团队采用3Brain高分辨率微电极阵列(HD-MEA) 平台 (BioCAM DupleX系统，配合CorePlate™ 1W 51/81大感应面积芯片，及BrainWave 4软件）对小脑脑片进行自发电活动记录，发现Cxcr4突变导致异常的小脑叶特异性网络活动，体现了高分辨率MEA平台解析不同解剖区域神经网络活动的优势。

此外，通过脑室内注射AMD3100（CXCR4拮抗剂），研究人员成功改善WHIM小鼠的小脑结构异常和行为缺陷，证明这些表型具有脑内特异性且依赖Cxcr4异常，而不仅仅是系统性免疫异常的继发结果。

综上，本研究揭示了IEI相关神经行为异常具有神经发育机制，拓展了传统上仅从免疫功能异常理解IEI疾病的认识。相关成果于2025年发表在 Neuron (IF= 16.9)。

3Brain HD-MEA揭示Cxcr4突变相关的小脑叶特异性功能异常
3Brain高分辨率微电极阵列平台在单孔 CorePlate^TM 1W 51/81 芯片上集成 4096 个同时记录的微电极通道（64 × 64 排布），均匀分布于5.1 × 5.1 mm² 的记录区域内（电极间距 81μm）。该系统支持全阵列同步记录，在实现对完整脑片活动全覆盖的同时，具备接近单细胞尺度的空间分辨率，实现了不同小脑叶神经网络活动的分析和可视化。

为分析Cxcr4突变对小脑神经网络功能活动的影响，研究团队利用3Brain HD-MEA对Cxcr4突变小鼠和对照组小鼠小脑急性脑片进行自发电活动记录。通过电活动图与脑片明场图像叠加，实现了电活动信号与不同小脑叶区域的对应分析（图1A）。记录的小脑脑片电活动主要反映浦肯野细胞的活动，并显示出稳定的自发放电信号（图1A、1B）。

进一步分析发现，尽管WHIM脑片在整个小脑范围内的平均放电频率 (Mean Firing Rate, MFR) 以及活跃记录单元 (active units) 的数量与对照组相比均无显著差异（图1D、1E），但不同小脑叶区域中观察到了明显的MFR差异（图1C）。其中，与异常裂隙 (fissure) 相邻的LIV–V和LVIII小脑叶表现出显著升高的MFR，而LII区域MFR降低；同时，LVIII区域的尖峰放电 (spike) 振幅也呈现升高（图1F）。此外，部分小脑叶区域的放电频率分布发生改变（图1G）。这些结果表明，Cxcr4突变引起的小脑功能异常并未表现为整体网络活动水平的显著改变，而主要体现为特定小脑叶区域功能异常。
 

图1. 3Brain HD-MEA 解析Cxcr4突变小鼠小脑脑片神经活动

(A) 脑片明场图像与 HD-MEA 记录的电活动分布图叠加，实现电活动信号与小脑解剖区域的对应分析。比例尺：2 mm。
(B) 对照组小脑脑片代表性电活动，包括随时间变化的放电事件（上）及单个活跃电极记录的动作电位信号（下）。
(C) 不同小脑叶区域平均放电频率的定量分析。点表示分析的脑片数量。采用Mann–Whitney检验进行统计分析，*p < 0.05；n > 6只动物/组。
(D) 突变组与对照组整个小脑区域平均放电频率的比较。
(E) 不同小脑叶区域活跃记录单元数量的定量分析。
(F) 不同小脑叶区域spike信号振幅的定量分析。
(G) 不同小脑叶区域放电频率分布分析。采用核密度估计 (Kernel Density Estimation) 分析。

3Brain HD-MEA实验流程
01. 急性小脑脑片制备与接种
实验选用出生后21天 (P21) 的小鼠。动物经异氟烷 (isoflurane) 深度麻醉后处死，随后立即取出脑组织，并置于预冷的切割液 (ice-cold cutting solution) 中进行后续处理。切割液成分包括 (mM)：87 NaCl、21 NaHCO₃、1.25 NaH₂PO₄、7 MgCl₂、0.5 CaCl₂、2.5 KCl、25 D-glucose以及7 sucrose，并持续通入95% O₂和5% CO₂混合气体使维持溶液pH在7.4。

随后利用振动切片机制备小脑蚓部 (cerebellar vermis) 旁矢状位 (parasagittal)  脑片，切片厚度为300 μm。脑片制备完成后，在室温条件下恢复至少1小时，随后置于33℃人工脑脊液 (ACSF) 中孵育，以维持组织活性。ACSF溶液组成包括 (mM)：129 NaCl、21 NaHCO₃、1.25 NaH₂PO₄、1.8 MgSO₄、1.6 CaCl₂、3 KCl以及10 D-glucose，并持续通入95% O₂和5% CO₂混合气体保持生理环境。

记录过程中，脑片持续灌流ACSF溶液，灌流速度为3.0 mL/min，并使用蠕动泵 (a peristaltic pump) 维持稳定灌流。

02. 数据采集（在BrainWave 4中配置）
记录过程中，利用宽度为100 μm的铂金固定锚 (platinum anchor) 将脑片稳定固定于电极阵列表面。

脑片在芯片上平稳10分钟后开始记录。信号采集参数设置如下：采样频率20 kHz，高通滤波截止频率50 Hz，记录时间5分钟。

每次记录结束后，使用高分辨率数字显微镜获取高清脑片图像，并将脑片图像与MEA活动分布图进行叠加，实现不同小脑叶区域的电信号与解剖结构对应分析。

03. 数据分析（在BrainWave 4中进行）
首先采用硬阈值 (Hard Threshold) 算法进行尖峰电位检测 (spike detection)，检测阈值设置为−70 μV，不应期 (refractory period) 设置为1 ms，并结合 AI-validation 功能对检测结果进行质量筛选。

随后，对单个电极记录的尖峰信号进行分选 (spike sorting)。通过主成分分析 (Principal Component Analysis, PCA) 提取3个特征维度，并结合标准K-means聚类算法完成不同放电单元的分离。

为保证数据质量，仅纳入满足以下标准的记录：spike放电频率高于0.8 spike/s, 每个小脑叶区域至少包含10个活跃记录单元。 若某一基因型样本无法满足上述标准，则该批次实验不纳入最终统计分析。

针对不同小脑叶区域，分别计算平均放电频率 (Mean Firing Rate, MFR) 和Spike振幅(Amplitude)，并采用中位数进行统计表征。此外，采用核密度估计 (Kernel Density Estimation, KDE) 方法对放电数据分布进行可视化和分析。采用非参数Mann–Whitney检验进行统计分析。

讨论与展望
脑片模型能够在保留天然组织结构和局部神经回路连接的基础上，对神经功能进行直接研究。然而，由于脑片通常包含多个具有不同功能特征的解剖区域，传统电生理方法难以同时兼顾组织覆盖范围和空间分辨率，从而限制了对区域特异性神经活动的解析。

本研究中，3Brain HD-MEA大面积、高分辨率的微电极阵列以及脑片光学图像，实现了电活动与具体解剖区域的空间对应分析，并将Cxcr4突变导致的网络活动异常定位到特定小脑叶区域。研究结果提示，在具有高度空间异质性的神经发育疾病或脑区特异性功能异常研究中，仅依赖整体平均指标可能掩盖局部功能变化，而具备空间分辨能力的HD-MEA技术能够进一步揭示区域特异性的网络异常。

此外，脑片实验不仅需要高质量电生理记录，也需要稳定的实验环境。3Brain平台提供灌流组件以支持脑片活性维持，并结合针对脑片模型优化的数据记录和分析模块。另外，结合BrainWave 6软件中的区域分析 (Zone Analysis) 功能，研究人员还可根据脑片解剖结构划分不同分析区域，对局部神经活动进行比较。

未来，HD-MEA技术可进一步结合单细胞测序、空间转录组、高分辨率成像以及细胞类型特异性标记，实现从分子机制、细胞状态到神经网络功能的多尺度关联分析。

参考与图片来源
Demenego, G., Mancinelli, S., Borreca, A., Proce, R. O., Aragona, V., Miotto, M., et al. (2025). Neurodevelopmental origins of structural and psychomotor defects in CXCR4-linked primary immunodeficiency. Neuron, 113(16), 2636–2655.e9. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2025.05.016

END

3Brain 链接未来，加速药物发现