小鼠肺癌组织单细胞样本制备标准流程及步骤

2026-08-21 来源:本站点击次数:81

一、实验前准备-全套试剂耗材

二、样本取材及预处理

小鼠鼠肺癌免疫细胞分离步骤
 将获取的新鲜肿瘤组织浸泡在预冷的组织保存液中，4℃保存及运输；
 将肿瘤组织转移至含有预冷1×PBS缓冲液（abs962）进行清洗，并尽量去除肿瘤组织表面脂肪和结缔组织；

三、标准化组织解离步骤参考
1、组织消化解离

 将清洗过的组织，剪碎成0.5-1 mm3左右的组织块，将组织块（约100 mg）转移至5 mL的离心管中，并加入1 mL解离液，将离心管置于37℃恒温培养箱中孵育30 min，每隔10 min可以上下颠倒离心管；孵育结束后，可以将解离好的组织混合液使用1 mL移液器缓慢吹打10-20次（注：尽量将组织剪碎，这样有助于解离液与组织充分接触，更好消化组织）；
 将孵育好的细胞悬液使用70 μm细胞筛网过滤至新的50 mL离心管中，加入3-5 mL含有10% FBS的RPMI-1640培养基缓冲液冲洗筛网并过滤；

2、Percoll密度梯度液配置（40%、80%）

40%Percoll溶液：Percoll细胞分离液与PBS缓冲液(10×)按体积比9:1混合，配制等渗100%Percoll母液。用100%Percoll母液和 RPMI1640/1×PBS按体积比4:6混合，配制40%等渗Percoll溶液。
80%Percoll溶液：Percoll细胞分离液与PBS缓冲液(10×)按体积比9:1混合，配制等渗100%Percoll母液。用100%Percoll母液和 RPMI1640/1×PBS按体积比8:2混合，配制80%等渗Percoll溶液。

3、Percoll 密度梯度提取目的细胞

 将上述得到的细胞悬液在4℃，400 g条件下离心5 min，弃去上清，用4 mL的40% Percoll重悬细胞沉淀；
 吸取2.5 mL的80% Percoll深入到新的15 mL离心管底部，试管稍微倾斜，将4 mL的40% Percoll与细胞的混悬液沿着管壁缓慢加入15mL离心管中，覆盖在80% Percoll溶液上面形成密度梯度；（注：不要破坏80%Percoll和40%Percoll与细胞混悬液的分界面，40%和80%Percoll现配现用。）
 室温条件下800 g离心20 min，升速1，降速0；
 离心结束后吸取中间层细胞至新的15mL离心管中，加入预冷的1×PBS缓冲液（abs962），上下颠倒混匀，4℃条件下400 g离心5 min，弃去上清；
 细胞沉淀使用适量的细胞染色缓冲液（abs9475）重悬，得到的细胞悬液可用于后续实验操作。

四、流式结果展示

试剂盒将小鼠肺癌组织处理为单细胞悬液后AO/PI计数结果

试剂盒将小鼠肺癌组织处理为单细胞悬液后流式检测细胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8a、CD11b、F4/80、Ly6C、Ly6G、CD326、CD31染色结果

实验所用试剂耗材

产品分类	产品编号	名称	规格
组织消化解离	abs50272	小鼠肺癌组织解离试剂盒	10T/25T
筛网	abs7232	70um细胞筛网（200目，白色，底面过滤）	50个/箱
免疫细胞预富集	abs9102	percoll	100ml
10XPBS缓冲液	abs961	PBS缓冲液（10×）	500ml
1640培养基	abs9484	RPMI 1640培养基（含L‑谷氨酰胺，不含HEPES）	500ml
红细胞裂解液（1×）	abs9101	RBC Lysis Buffer	100ml
阻断FCR非特异性染色	S0B0599	Mouse FcR Blocking Reagent	200T
染色缓冲液	abs9475	Flow cytometry staining buffer	500ml
死活染料	559925	7‑AAD Staining Solution 2mL	2ml
流式鉴定	S0B1692	APC‑Cy7 Rat Anti‑Mouse CD45 Antibody (30‑F11)	50T
流式鉴定	S0B5160	PerCP‑Cy5.5 Rat Anti‑Mouse/Human CD11b Antibody (M1/70)	50T

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