TR-FRET技术的原理、优势及激酶活性检测分析应用
2026-08-26 来源:本站 点击次数:95简述
均相时间分辨荧光（TR-FRET）技术将时间分辨荧光（TR）的低背景特性与荧光共振能量转移（FRET）的距离依赖性信号传递相结合，实现了对生物分子相互作用的均相、灵敏、高通量检测。该技术以镧系元素螯合物为能量供体、合适荧光基团为能量受体，通过测定供体与受体之间的能量转移效率来反映分子间结合或酶促反应进程，已成为药物筛选和信号通路研究的标配工具。
均相时间分辨荧光（TR-FRET）技术将时间分辨荧光（TR）的低背景特性与荧光共振能量转移（FRET）的距离依赖性信号传递相结合，实现了对生物分子相互作用的均相、灵敏、高通量检测。该技术以镧系元素螯合物为能量供体、合适荧光基团为能量受体，通过测定供体与受体之间的能量转移效率来反映分子间结合或酶促反应进程，已成为药物筛选和信号通路研究的标配工具。
一、TR-FRET的技术原理与核心组件
（一）FRET：距离依赖的能量转移
荧光共振能量转移（FRET）是一种非辐射能量转移现象，其发生需要满足三项基本条件：供体的发射光谱与受体的激发光谱存在重叠；供体与受体在空间上足够接近（1-10 nm）；供体的偶极取向与受体相匹配。当上述条件满足时，供体分子吸收激发光能量后，不通过发射荧光返回基态，而是通过偶极-偶极相互作用将能量转移至邻近的受体分子，使其被激发并发射特征荧光。FRET效率与供体-受体距离的六次方成反比，因此在反映分子间结合与解离方面具有极高的灵敏度。
（二）TR：长寿命信号的时间窗口
TR-FRET中的"时间分辨"特性来源于镧系元素（如铽Tb、铕Eu）作为能量供体。镧系螯合物被脉冲光源激发后，其荧光发射寿命极长（可达毫秒级），远高于普通荧光基团（通常为纳秒级）及生物样本中存在的背景自发荧光。仪器在脉冲激发后设置一段延迟时间（通常为50-100微秒），在此窗口内短寿命的背景荧光已经衰减殆尽，而长寿命的镧系供体信号以及经由FRET产生的受体信号仍可被检测。这一设计是TR-FRET获得高信噪比的关键。
（三）检测信号与均相体系
TR-FRET实验通常在微孔板中进行。当供体与受体因分子间结合而被拉近时，供体发射的能量可被受体吸收并产生FRET信号（通常为665 nm）；若目标分子未结合或发生解离，供体与受体距离较远，则不会产生FRET信号，供体自身在特定波长（如620 nm）的发射峰可被用作内部参照。
二、TR-FRET的核心技术优势
（一）高信噪比与低背景干扰
TR-FRET的时间分辨特性有效排除了短寿命的背景荧光和杂质信号，而均相检测模式省去了洗涤步骤，简化操作并降低了引入误差的可能。
（二）均相免洗操作与高通量兼容性
TR-FRET实验在液相中完成全部反应和检测，无分离或洗涤步骤，缩短了操作时间，减少操作偏差，且兼容96、384及1536孔板格式，适合自动化高通量筛选。
（三）信号比例化与批次间稳定性
通过计算受体信号（665 nm）与供体信号（620 nm）的比值，可校正由于加样体积、蒸发或不同孔间光径差异引起的系统波动，增强数据稳健性和跨批次可比较性。
三、基于TR-FRET的激酶——原理与应用
（一）激酶的基本功能与检测需求
蛋白激酶是一类催化磷酸基团从高能供体分子（如ATP）转移至特定靶蛋白底物的酶，是细胞信号传导的核心调控节点。其活性异常与肿瘤、炎症、代谢性疾病密切相关，使其成为药物研发的核心靶点之一。激酶活性检测的关键在于反映底物被磷酸化的程度或产物ADP的生成量。
（二）TR-FRET激酶检测原理
TR-FRET激酶检测通常采用抗体识别法或通用接头法。在通用型激酶检测中，反应体系中包含目标激酶、生物素标记的底物肽段、ATP以及偶联了FRET受体的检测抗体或结合物。激酶将ATP的磷酸基团转移至底物，生成磷酸化产物，随后被特异性抗体识别。体系中同时加入链霉亲和素标记的供体（如铽标记的链霉亲和素），利用生物素-链霉亲和素将供体锚定于底物附近，使供体与受体之间的距离被拉近，产生FRET信号。
（三）竞争性ADP检测模式
部分TR-FRET激酶检测方案基于ADP产生的竞争性原理。在反应系统中，ADP的生成量与激酶活性成正比。试剂盒中提供标记有FRET供受体的ADP示踪物，抗ADP抗体可同时结合示踪物和反应生成ADP。当激酶活性高时，反应液中游离ADP浓度升高，竞争性地将示踪物从抗体上置换下来，导致FRET信号下降。该模式适用于多种ADP生成型酶活检测。
四、均相时间分辨荧光相关技术服务哪里有？
乐备实可承接TR-FRET相关检测服务，基于标准化的均相时间分辨荧光检测体系，可开展激酶活性分析、药物竞争性结合试验及受体-配体相互作用检测等研究工作，为药物筛选、靶点验证及信号通路研究提供系统性的数据基础。
| 货号 | 产品名称 | 指标 |
|---|---|---|
| LXMH10-1 | 人炎症-10因子检测服务 | IFN-γ,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-6,IL-8,IL-10,IL-12p70,IL-13,TNF-α |
| LXLBH10-3 | 人代谢-10因子Panel检测服务 | C-Peptide,Ghrelin,GIP,GLP-1,Glucagon,Insulin,Leptin,PAI-1,Resistin,Visfatin |
|
6Ckine/CCL21,BCA-1/CXCL13,CTACK/CCL27,ENA-78/CXCL5,Eotaxin/CCL11,Eotaxin-2/CCL24,Eotaxin-3/CCL26,Fractalkine/CX3CL1,GCP-2/CXCL6,GM-CSF,GRO-α (Gro-a/KC/CXCL1),Gro-β/CXCL2,I-309/CCL1,IFN-γ,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-6,IL-8/CXCL8,IL-10,IL-16,IP-10/CXCL10,I-TAC/CXCL11,MCP-1/CCL2,MCP-2/CCL8,MCP-3/CCL7,MCP-4/CCL13,MDC/CCL22,MIF,MIG/CXCL9,MIP-1α/CCL3,MIP-1δ/CCL15,MIP-3α/CCL20,MIP-3β/CCL19,MPIF-1/CCL23,SCYB16/CXCL16,SDF-1α+β/CXCL12,TARC/CCL17,TECK/CCL25,TNF-α |
||
|
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