Ripk3-KO小鼠体内验证胆红素神经毒性新机制的研究
2026-09-30 来源:南模生物 点击次数:24胆红素是血红素代谢产物，传统上被认为具有抗氧化特性。然而当其水平升高时，脂溶性的非结合（游离）胆红素可穿过血脑屏障（blood–brain barrier, BBB），在新生儿核黄疸、肝性脑病等情况下造成神经损伤，其神经毒性的分子机制仍不清楚。另一方面，坏死性凋亡（necroptosis）的经典通路依赖RIPK1、ZBP1、TRIF等含RIP同型相互作用基序（RIP homotypic interaction motif, RHIM）的蛋白激活受体相互作用蛋白激酶3（receptor-interacting protein kinase 3, RIPK3），不依赖这类蛋白的激活机制同样知之甚少。
胆红素诱导不依赖RIPK1的坏死性凋亡
研究团队首先用多种细胞死亡途径抑制剂进行筛查，发现在SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中，只有MLKL抑制剂显著抑制了胆红素诱导的细胞死亡，凋亡、铁死亡、铜死亡及氧化应激相关抑制剂均无保护作用。在原代大鼠海马神经元和小鼠多巴胺能神经元细胞系MN9D中，胆红素以时间和剂量依赖的方式提高RIPK3与MLKL的磷酸化水平，而MN9D细胞中RIPK1的磷酸化未受影响。敲除MLKL显著减少了胆红素诱导的细胞死亡；敲除RIPK3的MN9D细胞可抵抗胆红素诱导的死亡，敲除RIPK1则不能。
胆红素直接结合RIPK3激酶结构域
研究团队合成生物素标记的胆红素，经亲和沉淀与质谱分析发现RIPK3是其潜在结合蛋白。竞争实验、细胞热位移分析（cellular thermal shift assay, CETSA）及重组蛋白实验进一步表明，胆红素可直接结合RIPK3并提高其热稳定性，而在重组蛋白实验中未检测到胆红素与RIPK1、ZBP1或TRIF的结合。胆红素还诱导RIPK3与MLKL形成高分子量寡聚复合物；基于MN9D细胞裂解液的激酶实验及ATP耗竭实验提示，胆红素以ATP依赖的方式增强RIPK3激酶活性。点突变实验显示，小鼠RIPK3的S102A和D161N突变破坏了胆红素结合，RHIM结构域突变则不影响结合；结合人源重组蛋白结果，研究团队确认人RIPK3的S101、D160及小鼠RIPK3的S102、D161是二者相互作用所需的残基。
RHIM结构域并非必需，激酶活性与二聚化必不可少
在敲除内源RIPK3的MN9D细胞中，RHIM结构域突变体与D161N突变体均不再响应经典诱导剂TNFα/zVAD-fmk，但RHIM突变体仍能介导胆红素诱导的MLKL磷酸化和细胞死亡，D161N突变体则不能；敲低ZBP1或TRIF也不影响胆红素诱导的细胞死亡。此外，缺失激酶活性的V36F突变体使胆红素无法诱导细胞死亡，破坏激酶结构域二聚化的R69H、R96G和H156G突变则抑制了胆红素诱导的细胞死亡，表明RIPK3的催化活性与二聚化均为此过程所必需。
Ripk3缺失减轻小鼠体内胆红素神经毒性
向Ripk3-KO小鼠侧脑室注射胆红素后，其海马和小脑中RIPK3与MLKL磷酸化较野生型小鼠明显降低，TUNEL阳性细胞的增加有所减弱，尼氏小体得以保留。在四氯化碳（CCl₄）诱导肝损伤、脂多糖（LPS）破坏血脑屏障的模型中，Ripk3缺失不改变血清胆红素水平，野生型与Ripk3-KO小鼠脑内非结合胆红素均升高，但仅野生型小鼠海马神经元出现RIPK3与MLKL磷酸化；Ripk3-KO小鼠运动活性改善，海马神经元死亡减少。此外，结合型胆红素既不诱导MN9D细胞死亡，也不与生物素标记胆红素竞争结合RIPK3，尼氏染色亦未见其引起小鼠神经毒性。
综上所述，此研究发现胆红素可作为RIPK3的激活剂，通过结合其激酶结构域中的S102和D161残基，在不依赖RIPK1及RHIM结构域的情况下激活RIPK3与MLKL，诱导非经典坏死性凋亡，从而参与胆红素引起的神经毒性。该研究提示RIPK3可能成为减轻高胆红素相关神经损伤的潜在干预靶点，研究团队也指出，开发可透过血脑屏障的RIPK3抑制剂是值得探索的方向。
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