图1：HAT 筛选的原理：从头合成途径与补救合成途径

这套设计有一个常被忽略的前提：筛选是负向的。它不挑出能分泌目标抗体的细胞，只淘汰掉不能活的细胞。因此 HAT 筛选之后，孔里能长的克隆仍然混杂，还需要一轮基于抗体特异性的检测。把 HAT 当成阳性筛选，是初学者常见的误读。

还要区分 HAT 与 HT。HT 只含次黄嘌呤与胸腺嘧啶，不含氨基蝶呤，用于筛选后的恢复培养——此时细胞不必继续承受氨基蝶呤的压力，但仍需要补救途径的底物。若把 HT 当作 HAT 使用，等于没有做筛选，未融合的骨髓瘤细胞会在压力解除后重新长起来。

筛选周期取决于细胞状态。一般在 HAT 中维持两周左右，期间可视情况半量换液；待孔内出现可见集落、且未融合细胞基本消失后再转出。转出过早，残留的缺陷株会混进来；转出过晚，细胞长期处在代谢压力下，状态会变差，扩增阶段需要更长时间恢复。

配制与保存上还有两点。氨基蝶呤对光敏感，含 HAT 的培养基应避光保存，配制后不宜久置；HAT 各组分的浓度是按补救途径的需求设定的，自行加量不会提高筛选效果，反而可能掩盖部分缺陷株的表现。

值得一提的是，氨基蝶呤的抑制作用是可逆的。撤去后从头合成通路会逐步恢复，这也是筛选结束后转回常规培养基可行的原因。但恢复需要时间，转出后短期内细胞仍偏脆弱，扩增阶段不宜立即提高传代比例。

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