摘要

应用高分辨率熔解曲线技术进行基因分型不仅简单而且有效。基于熔解曲线的分析方法中，探针法是进行基因分型的金标准，能够全面的检测匹配的目的等位基因。小片段扩增法是一种不需要设计探针进行基因分型的方法。由于异源双链的存在，杂合子很容易检测，而这很大程度上改变熔解转化的峰形。纯合子基因分型中G/C或A/T的改变是最难检测的，因为它们的等位基因有相似的Tm值。那些称为中性纯合子的碱基对使用小片段法是很难区分。此外，纯合子难区分也受样品与样品间温度的变化，缓冲液和体积的限制。无论多么精确的仪器，相关的变化可能是显著的，所以需要一种方法来减少这种变化并且改善小片段基因分型。而使用特异性内标就可以克服这些限制。

背景

人工合成的寡核苷酸内标和互补序列包含相同的分子浓度。在内标存在的情况下，使用普通96孔板PCR仪，并添加LC Green® Plus染料进行PCR反应。PCR反应完成后将PCR产物放入Lightsanner仪器，在55℃到97℃进行熔解曲线分析。内标的溶解识别通过每个样品的荧光数据进行校准。基因型通过测序进行验证。通过测量每个样品组相应的基因型的Tm值峰间的距离来估算校正前后的纯合基因型检测的错误率。当样品的Tm值与错误组的Tm值接近时，错误将被检测到。

结果

通过使用不同微孔板和PCR模板验证，使用温度内标校准后，纯和基因型在中性单核苷酸多态性碱基对检测的灵敏度提高了90%到99%以上。使用温度内标后Tm值标准较低大约0.056到0.027℃。

结论

内标提高小片段内的纯和基因型G/C和T/A碱基的改变。该研究被国家卫生部以下部分津贴支持：R44DK069106 、R44HD053215 to SFD 、 R42GM072419 和R42GM073396 to CTW。

背景

变性或熔解时，由于核酸固有特性的不同使得基因型信号会发生变化。基于探针的基因分型在相关的大量的等位基因特异性在温度变化几度上有较大的优势。高分辨率熔解曲线提供了整个双链的熔解图并且可以去掉探针。此外，每个实验当整个扩增子被监测时，获得的碱基审问数量增加达20倍。由于非常相似的熔解图和熔解温度，使纯和基因型在没有探针的情况下检测难度增加。小片段提供了一个简单的基因分型方案。
值得注意的是，与大片段扩增子相比小片段扩增能够更好的进行纯合子检测，因为特异基因型Tm值变化将更大。但是，某些因素可以影响大量纯合子的分离。从碱基类型Tm值变化到设备变化和样品和样品的不同都能影响基因分型。温度内标可以减小这些变化，固定熔解转变和提高基因分型的灵敏度。当小片段引物仅仅对侧翼的SNP匹配时，将会得到最好的结果。

方法

PCR反应体系10 μL，反应体系中加入1X LightScanner高灵敏度Mastermix，该Mastermix包含热启动酶，镁离子缓冲液，其它成分和核酸校准，该PCR的熔解区间大约在62C和92C。体系中包括0.10μM或0.15 μM的引物，人基因组DNA10-15 ng。PCR循环条件如下：95C预变性2min，94C/30s，64-67C/30s(根据实验而定)包含退火和延伸，45个循环。最后的退火条件为28C/30s。所有DNA样品的基因型通过探针法检测。
熔解在96孔板的LightScanner设备上进行，数据采集从55-97C。熔解后数据校准首先使用接近荧光数据的平滑线条，接下来，将使用该数据的线条插值峰计算Tm值。这一调整过程可以校准每个扩增子的熔解峰，以达到最小的变化。数据重新使用LightScanner软件进行分析。扩增子Tm值附近的温度区域用于分析（有或没有以前内标校准）同时以衍生峰显示。

结果

使用温度内标前的完整熔解图见图1，图中标出了从低温内标到高温内标的熔解图，中间为扩增子的熔解图。

图1. 衍生的熔解曲线显示了内标和扩增子的熔解峰。内标的熔解峰在左右两侧。94个熔解图产生于独立的PCR反应，熔解峰大约出现在76C。内标分子没有校准，纯合子的峰没有完全分开。中间最窄的和最高的峰是A/A(蓝色)和T/T(红色)，它是CPS1 A/T多态性的纯和基因型。先前基于探针的基因分型颜色已经增加,不是基于这个小片段熔解数据。中间的另一个峰是A/T杂合子峰。插图显示的是放大的熔解峰。
                       

图2. 使用温度内标能够改善衍生的熔解曲线。荧光图显示了CPS1、OTC,MSH2和PAH突变94个独立的PCR反应。双峰CPS1杂合子在校准前很容易被区分出来（图2a）。相反，OTC杂合子（图2c）仅显示了一条主要的峰，更多的峰在校准前很难区分。使用温度内标后的基因型数据分更加容易，重复反应中没有发现出现不同的基因型。

表1  比较每个目的基因使用温度内标前后四个重复的Tm。在所有情况下，校准后差异降低。可以看出，校准后标准差和非感兴趣区域差异都降低。

                                                    表1.校准对Tm值影响的统计

表1. 每个重复盘包含了相同设置的47个基因组DNA样品（94个独立的PCR反应）。基于所有纯合子邻近参数预测的Tm列于表中。杂合子Tm值不包含在内，因为它们通常在我们的系统中不用校准就可以分型。在某种程度上，由于LCGreen染料的存在，稳定的DNA杂交得到的实际Tm值要比理论值高5-7℃。基因分型没有调准是指未校准和标定Tm值有显著差异。（p＜0.001）。
对于CPS1和OTC PCR产物，分析预测近邻值未发现纯合子T/T和A/ATm的不同。然而，两个靶基因，即使没有校准， 纯合子群体Tm值也是不同的。尽管，从看到的Tm值范围上看，校准前纯合子T/T和A/A重叠。校准后，纯合子T/T和A/A没有重叠，说明纯合子已经区分开了（表1）。对于MSH2和PAH小片段产物，邻近值分析预测纯和扩增子之间有小的Tm值差异。校准前分析纯合子间的变化显示不能清楚的区分基因型。校准后，纯合子基因型的错误估测见表2。

                                               表2.校准提高纯合子检测灵敏度

表2. 实验数据显示了校准对灵敏度的影响。可以看出校准后检测灵敏度提高10%。实验中，正确的估计基于近似的Tm值， 而不是Lightsanner软件预测。每个目标小片段的错估预测将显示出来。
*OTC T/A突变的rs数未标出。

软件自动校准

随后的工作是用Lightsanner 软件自动对相似的图像的样品进行分组。这种图形的基因分型不需要对Tm值了解。对在这种基于Tm值的基因分型已经经过证实，这种基于图形的分型受益于温度内标的使用。图3可以看出通过校准CPS1的小片段产物得到改善。

图3. 温度内标能够改善Lightsanner软件自动校准。下面的显示板显示了归一化后的熔解曲线和不同屏幕截图。此外，从分组情况可以看出，屏幕上左方的盒子的红兰灰颜色在1-6列和7-12列是重复的模式。在这个资料组校准前得到的灵敏度是92%，校准后得到的灵敏度是100%。

校准降低Tm值对反应量的依赖性

Tm值依靠反应量预测，因为在反应板中更多的Mastermix或矿物油将阻碍热量的传递。这将提高显示的Tm值。我们使用OTC小片段测试Tm值对Mastermix反应体积的依赖。从7.0 μL到12.5 μL，以0.5 μL递增（厂家推荐为10μL）。Tm值对反应量的依赖性在校准前是很大的（slop=+0.069，R2=0.078），但在校准后（slope=-0.001，R2=0.066）,见图4。校准可以有效降低量对Tm值的影响。

图4.校准前后Mastermix体积对Tm值的影响。扩增OTC基因的47个样品评估C.299-8T＞A突变。该反应添加1 μL DNA模板，采用7.5 1 μL到12.5 1 μL以0.5 μL递增的Mastermix。A板显示的是校准前重要突变的熔解图。B板显示的是校准后减少的突变。C板显示的是35T/T纯合子样品校准前Tm值对Mastermix的量依赖性。校准后可观察到两种情况：1）误差线将压缩，突变显示减少2）斜率和R2值将大大减少，说明Tm值和Mastermix的量关系不大。对于每个反应在板子的不同方位分布，是为了降低Tm值对样品位置的依赖。

结论

小片段熔解是一种简单的基因分型方法，它不需要对样品进行PCR后处理。尽管较小的片段能够很好的进行基因分型。但是，没有温度内标的纯合子基因分析的成功不仅取决于高分辨率的数据采集，而且取决于样品间buffer、体积和提取的均一性。有效的校准可以消除这些混合因素的变化，以便于更好的相对稳定的进行纯合子基因分型。

参考文献
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4. Seipp, M. T., Durtschi, J. D., Liew, M. A., Williams, J., 4. Damjanovich, K., Pont-Kingdon, G., Lyon, E., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. (2007) Unlabeled Oligonucleotides as Internal Temperature Controls for Genotyping by Amplicon Melting. J Mol Diagn., 9, 284-9.