用于细胞培养的微载体

微载体培养（microcarrier culture）是一种用于高产量培养贴壁细胞的实用技术。CytodexTM专用于培养各类动物细胞，其培养体积可以从数毫升到6000升以上。应用Cytodex微载体技术，可以实现简单的贴壁细胞悬浮化培养，每毫升培养液可得到数百万细胞。微载体适于摇瓶、转瓶、搅拌罐以及WAVE生物反应器等各种培养系统。

 

Cytodex技术为进行动物细胞的培养提供了新的选择。该微载体为动物细胞的生长提供了适宜的表面，并可用于悬浮培养系统。还可用于增加单层细胞培养容器 （例如培养板、 培养皿及培养瓶）及灌注室（perfusion chambers）中的细胞产量。其应用范围为大量生产各类细胞、病毒及重组细胞产物（例如，干扰素，酶，核酸，激素）；研究细胞贴壁、分化及细胞功能；灌注柱式培养系统（perfusion column culture systems）；显微镜检查研究；获取有丝分裂细胞；分离细胞；膜研究；细胞的保存和运输，细胞迁移的检测及标记化合物的摄取研究。

 

产品特性

Cytodex 的设计能够满足微载体技术的特殊需要。

●Cytodex 的大小和密度经优化处理，以保证培养各类细胞时使其生长良好，产量提高。

●培养基架为生物学惰性，可为悬浮微载体培养提供坚实而非刚性的培养面。

●微载体透明，可直接使用显微镜观察或染色后观察。

Cytodex 1以交联葡聚糖基架 （cross-linked dextran matrix）为基础，该基架被带正电荷的N，N二乙胺基乙基基团（N, N-diethylaminoethyl groups）取代。该带电基团遍布于整个微载体基架中。

 

Cytodex 3含有一层较薄的变性胶原， 与交联葡聚糖基架化学偶联。 Cytodex3 上的变性胶原层易被胰蛋白酶和胶原酶等多种蛋白酶消化，因此，能在维持细胞最大活性、功能和完整性的同时将细胞从微载体上分离出来。

 

关于如何选择适合于某种特定应用的Cytodex的具体细节请参阅 《微载体细胞培养： 原理与方法》（18-1140-62）手册，GE Healthcare可提供本书。Cytodex1适用于通用微载体培养（general purpose microcarrier culture），尤其适用于大多数已建立的细胞系（established cell lines）。在对培养产物的最大回收率无要求时，该微载体也可用于原代细胞和正常二倍体细胞系的培养。Cytodex3是用于某些难以生长的细胞、分化细胞培养系统、尤其是具有上皮样形态学特征细胞的首选微载体。此外，在逐级扩增培养（scaling up）和需要最大限度的保留细胞活性和膜完整性的简单回收细胞时，推荐使用该微载体。

 

 

应用Cytodex进行微载体培养的具体细节，请参阅 《微载体细胞培养： 原理与方法》（18-1140-62）手册，GE Healthcare 可提供本书。

 

准备工作

干燥的微载体在无 Ca ^2＋和 Mg ^2＋的磷酸缓冲液（PBS）（每克Cytodex加 50-100ml）中在室温下浸

泡膨胀 至少 3 小时。弃去上清液，用新配制的无 Ca ^2＋、Mg ^2＋的 PBS（每克 Cytodex 加30-50ml）洗涤微载体数分钟。弃去 PBS，换上新的无 Ca ^2＋、Mg ^2＋的 PBS（每克Cytodex 加30-50ml），然后，微载体溶液用高压灭菌法灭菌（115℃，15min，15psi）。Cytodex非常稳定，可以反复（至少5 次）长时间（130℃，12h，27psi）进行高压灭菌而不影响其性能。所有溶液的 pH应为 7.4。

 

 

Cytodex 也可以用乙醇消毒。 微载体在用无Ca ²⁺、Mg ^2＋的 PBS 膨胀后沉降，弃去上清液，换上 70％（体积比）的蒸馏水稀释乙醇。用该溶液洗两遍微载体，然后移入新的70％的乙醇溶液（每克Cytodex 加 70-100ml）孵育过夜。然后，移去乙醇溶液，在使用前，Cytodex用无菌的无Ca ^2＋、Mg ^2＋PBS（每克Cytodex加50ml）洗 3 遍，用培养基（每克Cytodex加 20-50ml）再洗 1遍。

 

在使用前， 待无菌的微载体沉降后， 弃去上清液，用预热过的培养基（每克 Cytodex 加 20-50ml）简

单地洗1遍微载体。当微载体沉降后，倒掉上清液，将微载体转移至培养容器中。

 

细胞培养容器

有关培养容器的详细内容，请参阅《微载体细胞培养：原理与方法》手册。 简而言之，微载体培养液可置于各类细胞培养容器中。但是，应用一些在轻微搅动即可使微载体均匀悬浮的容器所获得的效果最佳，如WAVE生物反应器。那些在应用了能有效的混合悬液但不产生高剪切力的装置能够形成一个均匀的培养环境的容器就是进行通用微载体培养的最佳容器。在选择培养容器时，一定要考虑一些设计标准。如在培养过程中，搅拌桨不能和容器的内表面有任何接触，否则，就会破坏微载体。同样，轴承浸没在培养基内的旋转式

容器（spinner vessels）也不合适，这样，微载体可能会被旋转的轴承挤碎。市场上可购买到各种配套设计的系统，选择哪种系统主要根据所需培养容器的大小而定。此外，对于实验室，中试（pilot）及大规模生产应用还有很多其它培养容器。请联系GE医疗系统集团了解更多信息。

 

 

确切的细胞培养程序取决于细胞的种类和培养容器。在《微载体细胞培养：原理与方法》手册中对细胞培养

程序有详细介绍。根据系统的设计，微载体培养液通常含有1-5克/升的Cytodex，接种5×104-2×105细胞/毫升， 按20-60rpm速度搅拌。灌注微载体培养液（Perfused microcarrier cultures）可含高达20

g/升Cytodex。在首次进行悬浮微载体培养时，可参考以下介绍的一种方法。培养液的体积和接种量的大小应根据培养量的不同做相应的调整。配制100毫升的培养液， 应将0.3克的Cytodex溶于30ml培养基中，

加入到旋转式容器。再接种107细胞于该培养液中，轻轻混匀，37℃孵育。一旦细胞牢固地贴壁在微载体的表面，即开始连续搅动。细胞贴壁所需要的时间主要取决于该类细胞的贴壁效率（attachment efficiency）。如果细胞贴壁的时间过长，需要间断性（例如，每30分钟搅动2分钟）搅动培养液以保证细胞和微载体的均匀分布。然后，将培养液的容积增加到50毫升。搅拌的速度取决于培养容器，而且要足够快以防止微载体沉降。1至2天后，培养液体积增加至100毫升，3至5天后，部分培养基需要更换。培养不同类型的细胞，该程序可能需要做一些相应的调整。

 

从培养物中提取有代表性的微载体样本直接用相差显微镜检查或用用苏木紫染色后在显微镜下进行检查。检

测细胞数量最好的方法是使用标准 的 细 胞 核 记 数 法 （ standard  nucleus extrusion method ）。（Sanford， K.K.， Earle , W.R., Evans, V.J. et al., J. Nat. Cancer Inst. 11(1951)773－795）。

 

有多种方法可将细胞从Cytodex中移出。最常用的方法是使用蛋白水解酶如胰蛋白酶，胶原蛋白酶进行消化的标准方法。用胰蛋白酶回收细胞时，可使微载体沉降，倒掉培养基，再用pH7.6、含0.02％（质量体积比）乙二胺四乙酸（EDTA）的无Ca ^2＋、Mg ^2＋的PBS洗微载体5分钟。

 

EDTA-PBS溶液的量应按Cytodex  /克加50-100毫升。然后将EDTA-PBS溶液弃去，换上胰蛋白酶-EDTA（Cytodex/克加约30-50毫升）。然后在胰蛋白酶-EDTA溶液中将微载体混匀，37℃孵育，间歇式混合。15分钟后，加入含血清的培养基（Cytodex/克加20-30毫升培养基）中止胰蛋白酶的作用。此时，微载体内附着的所有细胞可通过轻轻的搅动脱落下来。再通过单位重力（unit gravity）离心沉降（常规回收法）

或通过直径100微米的过滤器过滤（回收率最高）将消化下来的细胞与微载体分离，分离的细胞用于接种到

下一轮的微载体培养中（比如，在逐级放大生产过程中）。如果用上述EDTA-胰蛋白酶回收方法不能得到满意的细胞回收率，可以进一步对消化过程参数进行仔细的优化，同时将所使用胰蛋白酶溶液的活性标准化。 请联系GE医疗系统集团了解更多信息。

 

游离细胞悬液。

 

每个批次的Cytodex都要经过严格的检验测定其理化和功能特性。每种细胞都要培养一周以上的时间以确保微载体能支持高密度细胞生长。所有批次Cytodex产品都可以提供一份含有这些检测结果的质量分析证书（Certifi cate of Analysis），可以来函索取。

 

供应与储存

Cytodex产品为干燥粉末，在使用前必须水化和灭菌。以下是供货包装规格：

未开封的 Cytodex 在干燥条件下储存，有效期达 5 年以上，用前述方法水化和灭菌的 Cytodex，可在4℃下、在PBS 中无菌储存至少两年。