Volker Andresen1,2, Stephanie Alexander1, Wolfgang-Moritz Heupel1, Markus Hirschberg1, Robert M Hoffman3 and Peter Friedl1,4

Current Opinion in Biotechnology 2009, 20:1–9

 

    多光子显微镜是一种在深层（厚）组织切片或者器官中观察细胞和细胞功能的一种方法选择。这里我们介绍一种使用激发光波长大约为1080nm的红外MPM IR-MPM的结构和应用。相比于传统MPM，IR-MPM可以使用红色荧光团和荧光蛋白标记，成像深度加倍，改善了组织结构的二次谐波产生，大大降低了光毒性和光漂白。而且，它可以在几百微米深度提供亚细胞分辨率的成像，因此强化了活细胞的长时间成像和深层组织成像功能。

    MPM（多光子显微镜）是一种用于活体或活细胞研究的重要测量技术，可应用于神经科学，免疫学和肿瘤研究。MPM的相对于其它成像方法的主要优势是它具备在活动物器官或组织内观察细胞运动，细胞-细胞间相互作用，和细胞内信号传递的能力。与激光共聚焦相比，MPM将成像深度大幅提升，从几十um到深达1mm在某种组织类型中，如大脑。相对激光共聚焦，更多的优点在于其内在的亚微米水平的空间分辨率可以允许揭示亚细胞水平的细节和精细的组织结构；由于激发光的长波长，降低了散射和吸收，并显著降低了离焦位置的光漂白和光毒性。而且，MPM能够进行内生荧光团的特征性紫外吸收波段激发和各向异性生物结构，如具有了大的超级化率的胶原蛋白和骨骼肌纤维的二次谐波发生SHG。

    除了这些优点外，多光子激发也具有显著地局限性：在光学致密样品，如包含结缔组织和细胞丰富组织中的穿透深度仍然不够，皮肤、淋巴结、肌肉、肾脏、和肿瘤；由于光的散射和光束轮廓的失真会导致成像深度增加的同时降低成像的空间分辨率；对敏感的细胞功能的光致毒性；对红色和近红外荧光团的激发不足。后者尤其重要，因为许多红移荧光团已经成为透过皮肤检测活动物深层组织病变的标准传感器，包括整个身体成像。一个补偿荧光团激发不足的通用方法是将激光能量增强到高于无毒害水平。但是，一旦超过一个特定的激光水平，激光能量增加带来的非线性光损伤增加速度快于激发光子数目的增加速度。因此强烈地增加了对敏感细胞和组织功能的光毒性伤害，如细胞分裂和信号传导。

    为了克服NIRMPM现存的某些缺点，尤其是限制的组织穿透深度，光诱导的细胞损伤，和红色荧光团的不良激发，此处我们描述了IR-MPM的结构和在活细胞和皮肤内深层组织成像、淋巴结和肿瘤损伤等方面生命科学的应用。

    通过使用一个光学参量震荡器OPO作为红外多光子光源，我们将多光子和二次谐波发生SHG显微成像推向红光波段。一方面，一个高重复率短脉冲的Ti：Sa激光器(Chemeleon XR, Coherent)产生710 to 980 nm的激光用于直接激发。另一方面，它作为一个基于非临界相位匹配交互作用的周期性极化晶体内的OPO(PP Automatic, APE)的泵浦光源 (Figure 1a). 光学参量震荡是一个将短波长光束转化为两个长波长可调谐光束（信号光束和空闲光束）的非线性过程。对于一个 775 或 830 nm的泵浦波长，OPO信号光束光谱范围为 1060 到 1450 nm.

    两束光都通过光束整形装置来控制它们的直径、准直、脉冲长度和能量，之后进入一个优化的可同时使用Ti：Sa和OPO激光的扫描头(TriM Scope, LaVision BioTec)。光束通过一个双色镜被单轴混合，之后共同被一对检流计扫描头反射。所用物镜(20 X IR,NA 0.95; Olympus)具有一个2mm长的工作距离可用于穿透深层组织，它被镀膜且对从430nm到1450nm的一个宽波长范围进行了修正。
系统性能和Ti:Sa与OPO激光的同时使用

    为了同时获取样品Ti：Sa和OPO的激发，一个分光器将Ti：Sa激光分解为泵浦OPO光束和直接成像光束(Figure 1a). 分光比例取决于足够激发所需的光亮，先后依赖于样品特征（光密度，连续性和荧光团吸收截面）和想要的成像深度。在实际应用中，一个90/10的分光比例对于泵浦OPO和直接进行Ti：Sa成像是有用的，可使830nm和1129nm的两束激光分别在其激发焦点处产生大约100mw的能量

 

    IR-MPM的光学分辨率通过测量红色荧光聚苯乙烯小珠的横向和轴向点扩散函数PSF来确定。对于0.95N.A的20 x IR物镜，激发光波长为1100nm时，水作为浸没基质，总计IR-MPM PSF的直径是横向564nm，轴向2240nm。这些值稍微大于理论数字，可能是因为对物镜在长激发波长不的修正引起的，也再次确认了先前使用1500nm120fs的脉宽激发的数据。因此，IRMPM适用于提供接近光学衍射极限的图像。

    在MPM中，荧光分子或蛋白被同时吸收的大于2个光子同时激发，它们共同为激发提供能量。这意味着最优的光学激发波长大约是相应单光子激发的两倍。因此，对红色荧光团的激发效率显著高于1100nm。

Figure 2 NIR和IR双光子激发和释放光谱。通过在同一焦平面对不同波长的Ti：Sa激光和OPO激光获取多幅图像并对扫描间的能量强度和漂白进行校正后的激发光谱。为获取红色和内在荧光团以及SHG的释放光谱，信号通过物镜，光谱仪和CCD相机检测。 (a) 自然状态下，SDS-PAGE前后的表达细胞质DsRed2 和组蛋白-2B-EGFP的HT-1080细胞.方框表明了光谱获取的区域。(b) EGFP, DsRed2, 和 Alexa Fluor 660的双光子激发光谱.实线代表了SDS-PAGE中分离的蛋白或Alexa Fluor 660，虚线代表了活的双色细胞中的。计算的1100nm对DsRed2的激发效率比760nm要高20倍。(c) 活的非固定的HT-1080双色细胞中830 nm对EGFP和1100 nm对DsRed2的同时激发。 Bars, 20 µm。

    从活的双色人纤维肉瘤细胞HT-1080获取的EGFP和DsRed的吸收和激发光谱展示了核EGFP/组蛋白-2B（H2B）和细胞质DsRed，以及从细胞中导出通过电泳分离的分离蛋白。(Figure 2a).据报道，对EGFP最有效的激发波长为930nm，但在1060和1350nm之间没有激发。相对的，DsRed在760nm处有一个小的激发峰，而从1090到1120nm处的激发效率是高于它20倍 (Figure 2b). Alexa Fluor 660表明在1070nm和1300nm间有一个1180nm的强激发峰(Figure 2b).

    使用两个不同波长的光束进行成像，它们的焦点必须精确地重合到一起。水平方向的通过对一个参比结构的成像如纵横交叉的胶原纤维的SHG成像调节一束光相对另一束的倾斜来实现。为匹配轴向的焦点位置，将会用到OPO的光束整形设备中的望远镜(Figure 1a, ‘T’).当进行一个滑过均质染料溶液的双光束激发的3D堆栈时，望远镜进行调整直到斜率重叠。 而且，非完全重叠将可能会导致来自不同样品平面的重像。使用EGFP和DsRed2在活的双色HT-1080细胞的同时激发，小的褶皱和核内结构被以非常好的空间分辨率检测到(Figure 2c),确定了IR-MPM在组织活细胞中高分辨率成像的应用。

    为同时激发荧光和其它特殊信号如组织结构中释放的SHG，用于混合激发的理想波长被确定。 由于SHG是一个非对称性过程，前向的信后是后向信号的4到8倍；因此，荧光和SHG信号的配准分别通过透镜和聚光器在后向和前向获取。纤维状胶原展示了来自一个输入波长范围最大1100和1189nm的窄的SHG带宽 (Figure 3a). 与NIR在纤维状真皮胶原产生的SHG信号相比，释放光强度比1100nm激发(V Andresen, WM Heupel, P Friedl, unpublished data)的光强5-30倍。SHG对自发荧光的比值大约为500:1(Figure 3b),这超过了Ti：Sa激发的典型比值。因此1100nm是一个适用于同步激发DsRed2，Alexa Fluor 660, 和富含胶原组织的SHG信号的合适OPO波长。

    对于活细胞显微成像，重复暴露在激光下会导致荧光团的光漂白，活性氧中间体的形成和热，最终在成像灵敏度和细胞活性与功能间进行折中。活细胞在1100nm处对DsRed2的光漂白分别低于以880nm和760nm激发的4到10倍 (Figure 4a).在117mw的高激光能量情况下，活细胞中的EGFP和DsRed2分别在500和1700次连续扫描后发生聚集，分别对应760nm和880nm，3和10分钟的连续照明(Figure 4b).作为对照，使用1100nm的激发波长进行10⁴次扫描或60分钟的连续照明时间后没有检测到蛋白的聚集(Figure 4b). 为排除非结构性和潜在的光损伤，由于肌动蛋白驱动的细胞迁移对能量依赖的即时性和对物理化学伤害的敏感性，检测了这一过程。尽管样品被暴露在1100nm的光下超过14小时(Figure 4c)，仍然没有发生细胞迁移或激光诱导的毒性，包括细胞变圆，蛋白质凝集或荧光的损伤。因此，IR-MPM展现了非常低水平的光漂白和光损伤。

Figure 3．IR双光子二次谐波信号(a) 自然状态人皮肤（左）中胶原蛋白丰富区域的SHG光谱（右）。方框，测量区域。(b) 1100nm处人类皮肤的释放光谱。方框表明了角质层，表皮和真皮中获取光谱的区域。纤维状胶原的SHG峰位于激发波长的一半处。

Figure 4．IR-MPM的光漂白，光毒性和组织穿透性. (a)以75mW能量的760, 880, and 1100 nm 激发波长连续扫描的释放光的下降时测量的DsRed2光漂白。样品被进行250次连续扫描，释放光强度以整个扫描区域的平均像素强度量化，并对首幅图像强度归一化。虚线表明了1100nm处的以释放光强度下降末端点进行归一化的漂白效率(b) 持续激发导致的蛋白凝结。双色HT-1080细胞在高激发能（110mW）和2.8幅/秒帧速下的连续成像。箭头和星号表明了凝结蛋白的聚集。(c)1100nm波长以焦点处117mW的能量强度连续激发期间，真皮切片中的多细胞球体中的HT-1080细胞向外迁移没有削弱。数字表明经过的时间。通过细胞跟踪获得的种群周转率与传统亮视野显微镜下监测的细胞比较。近乎完全重叠的迁移速率回归曲线被展示。用于SHG（d）穿透深度测量的4mm厚自然状态人皮肤切片和用于荧光（e）测量的直径1mm的双色HT-1080细胞球。对于二者，3维的皮肤或者多细胞球，880nm和1100nm以75mW能量的激发，SHG和荧光信号释放被以完全相同的PMT灵敏度检测。(d) and (e) 中的虚线展示了测得的50%的释放光信号强度，以之作为归一化的整个扫描区域的平均像素强度。标尺(c), 150 µm.

    虽然近红外光与可见光相比，水只能很少的吸收，但是水会增加对大于900nm的激发光的吸收，因此造成了IR-MPM在活的含水丰富组织的生物化学方面应用。考虑到这个因素，使用1100nm激发比880nm激发在人体皮肤纤维蛋白的原位观察方面最大成像深度增加了2倍(Figure 4d). 同理，水性基质中的DsRed2荧光细胞可以在固体多细胞球体结构中2倍深度的层次中检测到(Figure 4c).因此，如预先说的，IR-MPM适用于生物组织的更深层成像。

    因此，在移植的双色HT-1080细胞中，移植入小鼠皮肤8天后，使用1100nm激发对DsRed2信号的检测深度相对于使用880nm激发增加了2倍，可达500um（Figure 5a–c). 淋巴结内CMTMR标记的树突细胞从上皮层使用1100nm激发，成像深度可以达700um(Figure 6a–c).

    对于深层组织的多光子显微成像的另一个严重限制是随成像深度增加，空间分辨率下降。在使用近红外激发的淋巴结中，50um的成像深度时图像质量比表面成像下降了2到5倍。 Figure 5d 表明即使有足够的深层组织信号，细胞边界和亚细胞细节的分辨率也会受到散射性肿瘤组织的强烈影响。但是，我们的测量结果表明，IR-MPM比NIR-MPM显著降低了这种质量下降 (V Andresen, P Friedl, unpublished data).因此，对某些深层的窗口，IR-MPM提供了无与伦比的成像质量。

 Figure 5 活体中表达DsRed2的肿瘤移植物的IR深层双光子组织显微观察。植入小鼠皮肤的人类双色HT1080纤维肉瘤细胞，以75mW能量输入的(a) 880 and (b) 1100 nm激发的3D堆栈。Z轴的步长为5µm。V显示了一个大血管的区域（负对照） (c) 一个作为穿透深度功能的归一化的荧光强度。与皮肤表面下10到50 µm损伤位置相关的强度曲线的初始斜率(d) (b)中虚线展示的与1100nm激发在Z轴穿透深度的增加相伴随的空间分辨率的下降。插图展示的是全景图的细节放大。标尺 100 µm ((a) and (b)), 50 µm (d), and 20 µm ((d), 插图).

    这些结果表明红外双光子和二次谐波产生显微成像对于无毒害的时间分辨的细胞行为调查的深层组织成像尤其有利。作为与其它脉冲飞秒激光系统相比的优势，如Ch:forsterite (1230 nm) 和 Fianium fiber (1064 nm) 激光器，OPO产生的波长是可调谐的，适用于以一种弹性方式在它们的激发峰段对红色和近红外荧光团进行激发。由于没有分辨率方面的主要损失，1100nm到1300nm波长范围非常适用于红色和近红外荧光团，以及遗传编码的红移荧光蛋白(DsRed2, mCherry, TurboFP) 的双光子激发和宽带SHG，然而与NIR激发相比，它的限制性水分吸收倍增了间质组织和细胞丰富组织的穿透深度。

    强化IR-MPM的深入发展包括进一步的红移遗传编码荧光蛋白的构造；用于识别具有类似发射光谱的多光子荧光IR激发的荧光寿命成像研究；与光学相干层析的结合，用于预选感兴趣的研究区域；合适的光学器件的补偿。对于组织中的深层成像后者尤其重要，因为细胞膜，脂肪沉着体，及类似物造成的折射率局部改变削弱了激发波前，并因此显著地削弱PSF。在这个双光子显微镜中，不只是导致了图像质量的下降，而且导致了荧光的重大损伤，因为信号依赖于激光能量的平方。使用合适的光学器件和对给定深度进行一个单独的形状校正将会补偿样品产生的80%的畸变。

Figure 6  一个固定的淋巴结内树突细胞（DC）的3D重构。在腘窝淋巴结抑制前24小时，将同源未成熟的CMTR阳性DC注入Balb/C小鼠的脚掌中。 (a) 一个880nm激发波长的重构和(b)作为穿透深度功能的归一化的红色荧光(虚线区域的Z面测得). (c) 1100nm激发波长的重构(d)400–700 µm深的深层T细胞区域处的XY切片。激发能为 110 mW (1100 nm) 和 180 mW (880 nm). 标尺，100 µm.

    利用三次谐波产生THG和OPO激发CARS（相干反斯托克斯现象）的IR多光子显微成像对于原生状态的细胞和组织结构成像非常有用。三次谐波产生THG是一种由三阶非线性过程产生的类似SHG的非线性光学显微技术。因为非线性地依赖于激发能，THG具有内在光学切片的特点。它与近红外波长（1-2um）混合时非谐振的特性使得这种技术对于生物和非生物样品成像非常有趣。

    Nd:vanadate或者Ti：Sa激光器与泵浦OPO共同使用将充分使得CARS成为一个原生状态细胞和组织成像的有力工具。因此，Ti：Sa激光作为泵浦光束，而OPO激光作为CARS非线性过程的Stoks光束，适用于活细胞的脂类代谢和细胞器运输方面的研究。

    同时使用绿色和红色荧光团将会从当前的Ti：Sa和OPO系统发展中得到很多益处。最新的Ti：Sa激光器超过4W的一般特征性能量输出可以提供给两个激发光束几个100mw的能量。最后，一个新的OPO晶体的产生将会在一个宽范围调谐泵浦光束带宽因此支持绿色和红色荧光团的在各自激发峰同时激发。总之，越红越好的普遍观点对于深层组织双光子显微镜在生物医药研究的宽的应用范围内是正确的。

 

 

1 University of Wu¨ rzburg, Rudolf-Virchow Center for Experimental Biomedicine and Department of Dermatology, Venerology, and Allergology, Josef-Schneider-Strasse 2, 97080 Wu¨ rzburg, Germany

2 LaVision BioTec GmbH, Meisenstrasse 65, 33607 Bielefeld, Germany

3 AntiCancer, Inc., 7917 Ostrow Street, San Diego, CA 92111 and Department of Surgery, University of California, San Diego, 200 West Arbor Drive, San Diego, CA 92103-8220, USA

4 Microscopical Imaging Centre, Department of Cell Biology, Nijmegen Center for Molecular Life Science, Radboud University Nijmegen Medical Centre, P.O. 9101, 6500 HB, Nijmegen, The Netherlands

Corresponding author: Friedl, Peter (P.Friedl@ncmls.ru.nl)