该研究由Falko Fuhrmann、Felix C. Nebeling、Fabrizio Musacchio等学者共同完成，文章题为《Three-photon in vivo imaging of neurons and glia in the medial prefrontal cortex with sub-cellular resolution》，于2025年5月在线发表于《Communications Biology》。

重要发现
01三光子成像技术的搭建与优化
为了实现对mPFC的深层活体成像，研究团队搭建了一套先进的三光子显微镜系统。该系统采用了可调谐激光（1300-1700nm），激光重复频率稳定在2MHz，并配备了900-1900nm镀膜光学元件，确保长波长激发光的有效传输。

关键的技术优化包括：
色散补偿，通过棱镜补偿器减少飞秒激光在光路中的脉冲展宽，提升荧光激发效率，使1mm深度处的高亮度荧光信号更丰富，信噪比显著提高；

物镜选择，对比多款物镜后，选用了Olympus25x水浸物镜（数值孔径1.05，传输波长至1700nm），其在1mm深度的荧光强度和信噪比表现最优；

扩大探测光学元件尺寸，增加非弹道光子的收集角度（从8°增至14°），进一步提升信号质量。这些优化让系统能穿透小鼠颅骨窗口，清晰成像mPFC的各个区域和层级。

对于星形胶质细胞，团队通过表达GCaMP5g的小鼠模型，在1200μm深度观察到其钙活动，包括离散微域的自发钙事件和胞体的钙变化，且这些活动的振幅、持续时间和频率与浅层星形胶质细胞相似，表明深层星形胶质细胞的基础功能特性具有一致性。

在小胶质细胞研究中，使用1650nm波长激发红色荧光标记的小胶质细胞，首次在1100μm深度量化其突起的运动性，发现其周转率为58.9±2%，且连续两天成像显示运动特性稳定，证明该技术的低侵入性。

此外，研究还实现了树突棘密度的长期追踪：在1mm以下深度，连续一周记录到树突棘密度为0.41±0.07μm⁻¹，为研究神经元结构可塑性提供了新工具。

创新与亮点
01突破传统成像的深度瓶颈
传统双光子成像受限于光散射，在脑组织中的成像深度通常不足1mm，且难以实现亚细胞分辨率。而本研究的三光子成像技术通过采用1300-1700nm的长波长激光，显著减少了光在深层组织中的散射和吸收，将成像深度提升至1700μm，是双光子成像的1.5倍以上。这一突破让科研人员得以探索mPFC等以往难以触及的深层脑区，为理解全脑网络连接打开了新窗口。

总结与展望
本研究成功开发并应用三光子活体成像技术，在小鼠mPFC实现了1700μm深度的亚细胞分辨率成像，首次同时记录了神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的结构与功能特性，突破了传统成像技术的深度和侵入性限制。

展望未来，该技术将成为探索mPFC在认知功能（如工作记忆、情绪调控）中作用的核心工具，助力揭示阿尔茨海默病、精神分裂症等疾病的发病机制。同时，其在深层组织成像中的优势也有望扩展到其他器官研究，推动整个生物医学成像领域的发展，为精准医学和神经科学研究带来革命性突破。

DOI:10.1038/s42003-025-08079-8.