玩转10x之一：
scifi-RNA-seq 借助ATAC试剂盒实现
超高通量单细胞表达谱测序ifi-RNA

       奥地利科学院分子医学研究中心 (CeMM) 的研究人员开发了一种新的单细胞样品制备方法，single-cell combinatorial fluidic indexing (Scifi)，可将基于10x Chromium Controller平台单细胞RNA-seq的细胞通量提高15倍，这一成果发表在5月31日出版的Nature Methods上。
       在常规基于微滴的 scRNA-seq 中，进入到同一微滴中的两个细胞将使用相同的细胞标签标记它们的转录组，在数据分析过程中，这两个细胞的转录组数据将无法区分，从而产生了有偏差的结果。为了最大限度地减少双细胞微滴的比例，需控制上样细胞数，使得两个细胞不太可能进入同一个油包水微滴，大部分的微滴中仅含有Gel bead而不包含细胞。
       为提高油包水微滴的使用效率、释放其高通量分析的全部潜力，作者在scifi-RNA-seq方法中，首先透化处理细胞或细胞核，将它们的转录组通过split pools方法在384孔板里反转录，加上预索引标签，随后包含预索引标签cDNA的细胞或细胞核被汇集起来，10x上机制备油包水，生成的大多数微滴包有多个细胞或细胞核。应用10x scATAC Gel bead kit，在油包水内部cDNA又被标上10x cell barcode。虽然这两轮加的标签都不是单个细胞独有的，而是相应独立反应体系中的所有细胞共享的，但细胞或细胞核在两轮标签之间随机混合，两种标签的组合能够唯一地识别单个细胞。

•  经透化处理的细胞或细胞核微孔板里进行反转录，并加上孔位特异性的第一轮标签

• 细胞带着加标签的cDNA进行10x上机，每个油包水里有1个Gel bead和多个细胞

• 细胞在油包水中裂解

• cDNA通过等温连接加上第二轮即Gel bead上的10x barcode标签

• 通过识别两轮标签组合拆分单细胞数据

       scifi 方法在概念上不同于cell hashing，cell hashing标签区别的是各个样品，而scifi基于全转录组预索引标签，可以将转录本从超量上样的油包水中溯源为各自的单细胞转录组。另外，scifi在可操作性上优于传统的多轮组合标签的方法，多轮组合标签实验流程繁琐，且每个细胞的转录组复杂性较低。Scifi将微孔板和微流控组合，在 Chromium Controller系统的每个通道可获得多达 150,000个单细胞转录组，每张芯片100 万个单细胞转录组，且每个细胞能够获得高复杂性的转录组数据。作者用多种细胞系以及原代细胞进行了方法学验证。作者推测scifi-RNA-seq 最可能立即用于两个领域：追求复杂组织、器官或整个生物体的单细胞表征的细胞图谱项目，以及高通量扰动研究，包括药物筛选和单细胞 CRISPR 筛选。

滴~EMTD温馨提示

       目前此方法仍处于学术研究、实验室研发范畴，未达到经反复检验的商业化应用阶段。10x 目前已推出超高通量的Chromium X及试剂 ，结合CellPlex 试剂盒，单张芯片通量可达到百万细胞级别。
 

玩转10x之二：
ASAP-seq, Dogma-seq单细胞DNA/RNA/Protein
中心法则三要素一网打尽

       美国纽约基因组中心的研究人员开发了两种单细胞多组学检测方法，一种是借助10x scATAC试剂盒，在单细胞水平同时检测染色质可及性、蛋白水平和线粒体DNA，命名为ASAP-seq (ATAC with select antigen profiling)。在文章的审稿过程中，10x推出了GEX+ATAC的单细胞多组学试剂盒，作者在此基础上又开发了一种新方法Dogma-seq，实现单细胞同时检测染色质可及性、mRNA表达、蛋白水平和线粒体DNA克隆追踪四重信息。这一成果发表在6月3日出版的Nature Biotechnology上。
       常规做ATAC-seq通常要尽量减少线粒体DNA的干扰，但作者认为如果能够富集获得高覆盖度的线粒体信息，就可以通过线粒体基因组携带的突变进行追踪，以研究细胞间的相互关系。作者又基于CITE-seq技术还开发了一套bridge oligos，使得带oligo标签的抗体检测可以整合到ATAC-seq的流程中。

       上图详解了ASAP-seq如何将蛋白检测整合进scATAC-seq的工作流程。a.细胞样品前处理用连有oligo的抗体染色，而后对细胞进行固定、透化处理、Tn5酶专座。b.在油包水微滴内，抗体标签结合外加的bridge oligos并以其为模板延伸，延伸后可以同Gel beads上的oligo互补，后续抗体标签和ATAC酶切下来的DNA片段均被加上细胞Barcode。
      作者进一步将蛋白检测推进到细胞内蛋白水平，ASAP-seq的细胞固定后透化处理步骤有可能用于检测胞内蛋白，而这在高通量的scRNA-seq中是无法做到的。作者用不同接头的抗体标签以区别胞内和细胞表面蛋白，用细胞表面蛋白TSA TBNK panel和3种TSB胞内蛋白抗体染色PBMC，在根据单细胞ATACT结果分群的图中，蛋白marker的分布与先验知识以及基因活性值是一致的。

       上图展示了ASAP-seq检测细胞表面及胞内蛋白的实验设计和结果。a.PBMC先染细胞表面的TSA TBNK Panel，进行细胞固定和透化，而后染TSB胞内的蛋白。b.PBMC根据ATAC结果分群，将主要的外周血细胞类型进行了注释。c和d分别显示了细胞表面和胞内蛋白细胞分布。         Dogma-seq借助10x的多组学试剂，蛋白检测应用带Poly A的Total-seq A抗体标签，可以和多组学Gel bead上的oligo T互补。作者测试了LLL和DIG不同的细胞透化方法，LLL是指使用0.1% PFA / 0.1% NP40，DIG方法为使用0.01% Digitonin，结果显示LLL可得到更多更完整的线粒体DNA信息用于追踪，而DIG方法可以更好地检测细胞表面蛋白。