NextSeq1000、NextSeq2000和NextSeq550测序系统之间的数据一致性
2021-12-16 来源:Illumina因美纳公众号 点击次数:3819简介/Introduction
在过去的20年里，Illumina引领了新一代测序（NGS）技术的变革，使探索基因组、转录组和表观基因组变得更简单，也更经济。Illumina推出的最新平台NextSeq 1000和NextSeq 2000测序系统，提供了突破性的系统设计、创新的化学测序技术、可兼顾多种文库制备方法的高兼容性，以及机载集成式生信分析软件。
NextSeq 1000和NextSeq 2000测序系统均采用Illumina边合成边测序（SBS）化学技术，该技术支持包括NextSeq 550系统在内的所有Illumina平台。Illumina SBS化学技术生成了全球90%以上的测序数据1，该技术可大大减少错误read2，实现了全基因组范围内的可靠碱基检出3。
NextSeq 1000和NextSeq 2000系统经过优化后增强了簇亮度，减少了通道串扰，并提高了信噪比。NextSeq 1000和NextSeq 2000测序系统结合了光学和仪器设计领域的最新技术，提高了数据输出量，降低了每次运行的成本，同时生成用户所期待的，与NextSeq 550系统一样的高质量数据。
本应用说明表明NextSeq 1000和NextSeq 2000测序系统在关键应用（包括外显子组、群体细胞和单细胞RNA基因表达）中可呈现出与NextSeq 550系统相当的数据质量。
方法/Methods
外显子组测序
使用Nextera™ DNA Flex Pre-Enrichment Library Prep and Enrichment Reagents Kit（Illumina，货号 20025524）从NA12878基因组 DNA（gDNA）（Coriell医学研究所）样本中制备外显子组文库，再由Illumina Exome Panel（Illumina，货号 20020183）捕获其中的目标基因组区域。
使用NextSeq 1000/2000 P2 Reagent Kit（200 个 循 环 ）（Illumina 货号 20040557）在 NextSeq 2000*系统上测序，运行配置为 2×100 bp。为了进行比较，使用NextSeq 500/550 High-Output Kit v2.5（300 个循环）（货号 20024908）在NextSeq 550系统上对相同文库进行测序，运行配置为 2×100bp。每台仪器在单次运行中可对 8 个样本进行多重测序。
*尽管 NextSeq 2000系统的通量高于 NextSeq 1000系统，但两者的性能和数据质量不相上下。因此，本应用说明中仅选用NextSeq 2000系统进行数据比较研究。
使用DRAGEN™ Enrichment Pipeline v3.4进行二级数据分析，它可在NextSeq 2000系统上运行或通过BaseSpace™ Sequence Hub运行。根据 Platinum Genomes 2016 v1.0数据集评估变异检出的准确性4。
群体细胞mRNA测序
使用TruSeq™ Stranded mRNA Library Prep Kit（Illumina，货号20020594）从通用人类参比 RNA（Coriell 医学研究所）样本中制备信使RNA（mRNA）文库。
使用NextSeq 1000/2000 P2 Reagent Kit（200 个循环）在NextSeq 2000系统上对其测序，运行配置为 2×76bp。为了进行比较，使用NextSeq 500/550 High-Output Kit v2.5（300 个循环）在 NextSeq 550系统上对相同文库进行测序，运行配置为 2×76 bp。每台仪器在单次运行中可对24个样本进行多重测序。
使用DRAGEN RNA Pipeline v3.5.112进行二级数据分析，它可在NextSeq 2000系统或BaseSpace Sequence Hub上运行。数据与基因组参照序列联盟的人类标准基因GRCh38（组装 h38）进行比对。
单细胞RNA测序
单细胞RNA测序（scRNA-Seq）的样本是用4重外周血单核细胞（PBMC）制备的，后者从单个供体的全血中分离而来。使用Chromium Single Cell Gene Expression v3 Solution（10x Genomics，货号1000092）在Chromium Controller（10x Genomics，货号 120223）上从约1000个PBMC中制备文库。
使用NextSeq 1000/2000 P2 Reagent Kit（200 个循环）在NextSeq2000系统上对其测序。为了进行比较，使用NextSeq 500/550 High-Output Kit v2.5（150 个循环）（Illumina，货号20024907）在NextSeq 550系统上对相同文库进行测序。根据10x Genomics提供的参数设置运行配置：read 1 28个循环，index read 8个循环，read 2 91个循环。
使用Cell Ranger scRNA-Seq分析流程（10x Genomics公司）进行数据分析，以比对read、成簇和分析基因表达。
结果/Results
外显子组测序
评估包括单核苷酸位点变异（SNV）和插入 / 缺失（indel）的查准率和查全率、运行输出数据量（产量）、错误率、匹配read百分比、平均靶点覆盖深度和覆盖度均一性在内的初级和二级分析指标。NextSeq 550和NextSeq 2000系统在测序数据输出量和数据质量方面都超过了公布的技术规范，两个测序平台都保有出色的测序性能（表1）。这些数据表明，NextSeq 2000系统和 NextSeq 550系统的外显子组测序结果不相上下，两个平台都能提供高质量的数据和高度准确的变异检出。
表1：外显子组测序性能相当
群体细胞mRNA测序
NextSeq 550和NextSeq 2000系统在测序数据输出量和数据质量方面都超过了公布的技术规范（表2）。通过群体细胞mRNA-Seq对特定RNA靶点进行定量，结果表明在四次重复实验中两个平台之间具有良好的一致性（R2>0.99）（图1）。这些数据证实了在定量 mRNA 表达水平时，NextSeq 2000系统生成的数据质量与NextSeq 550系统相当。
表2：群体细胞mRNA-Seq性能相当
图1：高度一致的mRNA-Seq结果——使用NextSeq 550系统通过细胞群mRNA-Seq 对特定 RNA 靶点进行定量，并绘制在 y 轴上。NextSeq 2000 系统的结果绘制在 x 轴上。沿着 y = x 趋势线观察数据的一致性（四次重复试验的R2>0.99）。
单细胞全转录组测序
NextSeq 550和 NextSeq 2000系统在测序数据输出量和数据质量方面都超过了公布的技术规范（表3）。在 scRNA-Seq 中使用独特分子标签（UMI）对单个细胞进行定量，结果表明在四次重复实验中两个平台之间具有良好的一致性（R2>0.99）（图2）。这些数据进一步证明在开展 scRNA-Seq 研究时，NextSeq 2000系统生成的数据质量与NextSeq 550 系统相当。
表3：scRNA-Seq性能相当
图2：scRNA-Seq结果高度一致——使用 NextSeq 550 系统通过 scRNA-Seq 对单个细胞（UMI）进行定量，并绘制在 y 轴上。NextSeq 2000 系统的结果绘制在 x 轴上。沿着 y = x 趋势线观察数据的一致性（四次重复试验的 R2>0.99）。
总结/Summary
NextSeq 1000和NextSeq 2000测序系统具有突破性的系统设计、创新的化学测序技术并且机载生信分析软件，彻底改变了台式测序系统的性能。这些平台降低了测序成本并提高了运行能力，同时保持了用户对Illumina期望的高质量数据。将常在NextSeq 550 系统上运行的关键应用数据，包括外显子组、群体细胞mRNA和单细胞 RNA 测序，直接与NextSeq 2000系统生成的数据进行比较。结果显示，NextSeq 550和NextSeq 2000系统的性能高度一致，反映了 Illumina对始终提供一致、高质量的测序性能的承诺。
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如需下载本说明中提及的数据集，请访问：basespace.illumina.com/datacentral
仅供研究使用。不得用于诊断。
参考文献
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Data calculations on file. Illumina, Inc. 2017.
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Based on a comparison of the top three industry-leading NGS platforms. Data calculations on file. Illumina, Inc. 2016.
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Ross MG, Russ C, Costello M, et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biol. 2013;14:R51.
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Eberle MA, Fritzilas E, Krusche P, et al. A reference data set of 5.4 million phased human variants validated by genetic inheritance from sequencing athree-generation 17-member pedigree. Genome Res. 2017;27:157–164.