外泌体研究-蛋白质组学应用多个经典案例的解析
2022-01-30 来源:本站 点击次数:1731
对于疾病研究，生物标志物（Biomarker）是指可供客观测定和评价的一个普通生理病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标，通过测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。检查一种疾病特异性的生物标志物，不仅可从分子水平探讨发病机制，而且在准确、敏感地评价早期、低水平的损害方面有着独特的优势，可提供早期预警、预后疗效分析、疾病精准的分期分型依据等。寻找和发现有价值的生物标志物已经成为目前研究的一个重要热点。
蛋白质是执行生物学功能的活性生物大分子，和传统方法相比，蛋白质组学能够更直接地鉴定到病人和正常人之间差异表达的蛋白，成为发现生物标志物的重要途径。
今天随小希一起学习一种外泌体蛋白组学常见研究模式——通过蛋白质组学寻找疾病发生发展的新型标志物。
案例：阿尔兹海默症潜在非侵入性早期生物标志物鉴定—外泌体蛋白质组学分析
研究背景
阿尔兹海默症（AD）是常见的老年性疾病，是一种不可治愈的神经退行性疾病。患者大脑中会出现淀粉样蛋白斑块沉积，这些沉积物能破坏脑神经组织的结构与功能，导致神经细胞死亡和认知功能丧失。阿尔兹海默症在β-淀粉样斑块沉积发生之前，识别候选生物标志物对于AD的早期干预具有重要意义。
样本来源
技术方法
蛋白质组学、生物信息学分析、多反应监测（MRM）、WB（Western blot）、ELISA。
研究目的
研究1月龄（β-淀粉样斑块沉积前）的小鼠模型与对照小鼠尿液外泌体蛋白质组，探讨潜在AD早期生物标志物。
技术路线
研究内容
STEP1
样本收集
收取5XFAD小鼠及同窝对照小鼠的尿液样本，分离提取外泌体。
STEP2
外泌体鉴定
NTA粒径浓度分析：对照组和5XFAD组的尿液来源外泌体进行NTA定量分析，其外泌体的平均直径分别为120.8±43.0 nm和103.2±34.1 nm 。5XFAD组尿液来源外泌体平均直径小于对照组，但5XFAD组尿液外泌体浓度高于对照组。
TEM电镜验证外泌体形态：呈扁平球形或圆形，双层膜结构。
WB验证外泌体标志物表达：检测到外泌体跨膜蛋白：CD10、CD63和Flotillin 1；细胞溶质蛋白：Alix和TSG101。另外白蛋白是用于评估尿液对外泌体的影响即外泌体纯度。实验表明，从尿液中分离的外泌体相对均一，没有尿液污染，并且含有外泌体特异性标记。
STEP3
蛋白质组学研究
差异蛋白筛查
外泌体蛋白质进行LC-MS/MS定性和定量分析，5XFAD组和对照组之间的88种尿液外泌体蛋白存在显著差异。与对照组相比，53种蛋白表达上调（比率≥1.2，P值<0.05），27种蛋白表达下调（5XFAD组为0.83，P值<0.05）。
聚类分析显示了具有相似表达谱的不同层次蛋白质簇，18种蛋白质是5XFAD组所特有的。相反，在对照组中仅发现一种独特的蛋白质。在这些差异表达的蛋白质中，11种蛋白质也是大脑中的细胞标志物，并被选作进一步研究。具体而言，至少有30种蛋白质被报道与AD的病理机制或发展相关，而6种被确定为AD生物标志物并且有很大潜力被认为是AD的候选尿液外泌体生物标志物。
蛋白质组学聚类分析和GO分析比较, 根据差异表达蛋白和尿液外泌体无偏聚类分析，对差异表达蛋白质进行GO饼图分析，以研究对照组和5XFAD小鼠样本之间的特定MFs、BP和CCs，并根据不同GO术语确定的基因数量进行比较。
WB、ELISA和MRM靶向蛋白分析验证差异蛋白
根据定性和定量分析，在5XFAD组和对照组之间，有88种尿液外泌体蛋白存在显著差异。根据蛋白质组学分析的结果，共选择22种蛋白质进行下一步验证。为了使靶蛋白之间的关系更加清晰和直观，进行了22种靶蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析和MRM分析。
对照组和5XFAD小鼠靶蛋白的PPI分析和MRM分析，PPI分析显示了目标差异蛋白之间的关系。两种蛋白质之间的线越多，相互作用的可能性就越大。MRM测定了对照组和5XFAD小鼠之间22种靶蛋白的相对峰面积。
结果表明：
FUCA2、Ly86、PrP、Annexin 2和Fuca1在两组之间存在显著差异。
WB、ELISA和MRM靶向蛋白分析验证22个靶蛋白。与对照组相比，HEXB（溶酶体和/或自噬途径蛋白）在尿液外泌体蛋白中显著增加，这与5XFAD小鼠大脑中HEXB的差异表达一致。
另外四种蛋白质，AOAH、Clustrin、Ly86和Preol，表现出相同的趋势，在蛋白质组和WB分析中存在显著差异。与对照组相比，5XFAD组的AOAH水平显著升高；相反，Clustrin、Ly86和Preol水平明显降低。
研究结论
共鉴定出316种蛋白质，包括44种脑细胞标志物。重要的是，18种蛋白质是5XFAD组所独有的。共有88种蛋白质（包括11种脑细胞标志物）差异表达。WB验证进一步证实这些蛋白质中有5个存在显著差异。
本研究思路清晰，选择对照组和模型小鼠样本，取尿液外泌体样本，进行蛋白质组学分析，获得差异表达蛋白，然后对筛选的差异蛋白进行验证，验证结果表明一些尿液外泌体蛋白，尤其是Annexin 2和Clusterin能够检测淀粉样β斑块沉积前的差异，这可能是预防AD的理想非侵入性生物标志物来源。
再回顾借鉴此文研究思路
Dr.Cell实验室根据研究者的不同需求，提供差异化的蛋白质组学技术服务以及外泌体整体服务方案。
关注逍鹏生物公众号→进入右下角“检测服务”→轻松下单
参考文献
Song Z, et al. Comprehensive Proteomic Profiling of Urinary Exosomes and Identification of Potential Non-invasive Early Biomarkers of Alzheimer's Disease in 5XFAD Mouse Model. Front Genet.2020;11:565479.
蛋白质是执行生物学功能的活性生物大分子，和传统方法相比，蛋白质组学能够更直接地鉴定到病人和正常人之间差异表达的蛋白，成为发现生物标志物的重要途径。
今天随小希一起学习一种外泌体蛋白组学常见研究模式——通过蛋白质组学寻找疾病发生发展的新型标志物。
案例：阿尔兹海默症潜在非侵入性早期生物标志物鉴定—外泌体蛋白质组学分析
研究背景
阿尔兹海默症（AD）是常见的老年性疾病，是一种不可治愈的神经退行性疾病。患者大脑中会出现淀粉样蛋白斑块沉积，这些沉积物能破坏脑神经组织的结构与功能，导致神经细胞死亡和认知功能丧失。阿尔兹海默症在β-淀粉样斑块沉积发生之前，识别候选生物标志物对于AD的早期干预具有重要意义。
样本来源
5XFAD小鼠及同窝对照小鼠的尿液样本。5XFAD小鼠携带5个家族性基因突变的APP/PS1转基因AD小鼠模型，该小鼠重现了阿尔兹海默症淀粉样蛋白病理的主要特征，可作为研究AD发病机制、治疗靶点及治疗药物的动物模型。
技术方法
蛋白质组学、生物信息学分析、多反应监测（MRM）、WB（Western blot）、ELISA。
研究目的
研究1月龄（β-淀粉样斑块沉积前）的小鼠模型与对照小鼠尿液外泌体蛋白质组，探讨潜在AD早期生物标志物。
技术路线
研究内容
STEP1
样本收集
收取5XFAD小鼠及同窝对照小鼠的尿液样本，分离提取外泌体。
STEP2
外泌体鉴定
NTA粒径浓度分析：对照组和5XFAD组的尿液来源外泌体进行NTA定量分析，其外泌体的平均直径分别为120.8±43.0 nm和103.2±34.1 nm 。5XFAD组尿液来源外泌体平均直径小于对照组，但5XFAD组尿液外泌体浓度高于对照组。
TEM电镜验证外泌体形态：呈扁平球形或圆形，双层膜结构。
WB验证外泌体标志物表达：检测到外泌体跨膜蛋白：CD10、CD63和Flotillin 1；细胞溶质蛋白：Alix和TSG101。另外白蛋白是用于评估尿液对外泌体的影响即外泌体纯度。实验表明，从尿液中分离的外泌体相对均一，没有尿液污染，并且含有外泌体特异性标记。
STEP3
蛋白质组学研究
差异蛋白筛查
外泌体蛋白质进行LC-MS/MS定性和定量分析，5XFAD组和对照组之间的88种尿液外泌体蛋白存在显著差异。与对照组相比，53种蛋白表达上调（比率≥1.2，P值<0.05），27种蛋白表达下调（5XFAD组为0.83，P值<0.05）。
聚类分析显示了具有相似表达谱的不同层次蛋白质簇，18种蛋白质是5XFAD组所特有的。相反，在对照组中仅发现一种独特的蛋白质。在这些差异表达的蛋白质中，11种蛋白质也是大脑中的细胞标志物，并被选作进一步研究。具体而言，至少有30种蛋白质被报道与AD的病理机制或发展相关，而6种被确定为AD生物标志物并且有很大潜力被认为是AD的候选尿液外泌体生物标志物。
蛋白质组学聚类分析和GO分析比较, 根据差异表达蛋白和尿液外泌体无偏聚类分析，对差异表达蛋白质进行GO饼图分析，以研究对照组和5XFAD小鼠样本之间的特定MFs、BP和CCs，并根据不同GO术语确定的基因数量进行比较。
KEGG路径分析显示富集倍数最高的15种蛋白质。PPI蛋白互作网络分析展示蛋白的互作情况。
WB、ELISA和MRM靶向蛋白分析验证差异蛋白
根据定性和定量分析，在5XFAD组和对照组之间，有88种尿液外泌体蛋白存在显著差异。根据蛋白质组学分析的结果，共选择22种蛋白质进行下一步验证。为了使靶蛋白之间的关系更加清晰和直观，进行了22种靶蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析和MRM分析。
结果表明：
FUCA2、Ly86、PrP、Annexin 2和Fuca1在两组之间存在显著差异。
WB、ELISA和MRM靶向蛋白分析验证22个靶蛋白。与对照组相比，HEXB（溶酶体和/或自噬途径蛋白）在尿液外泌体蛋白中显著增加，这与5XFAD小鼠大脑中HEXB的差异表达一致。
另外四种蛋白质，AOAH、Clustrin、Ly86和Preol，表现出相同的趋势，在蛋白质组和WB分析中存在显著差异。与对照组相比，5XFAD组的AOAH水平显著升高；相反，Clustrin、Ly86和Preol水平明显降低。
对照组和5XFAD小鼠分离的尿液外泌体中的11种差异蛋白进行WB和定量分析验证。
研究结论
共鉴定出316种蛋白质，包括44种脑细胞标志物。重要的是，18种蛋白质是5XFAD组所独有的。共有88种蛋白质（包括11种脑细胞标志物）差异表达。WB验证进一步证实这些蛋白质中有5个存在显著差异。
本研究思路清晰，选择对照组和模型小鼠样本，取尿液外泌体样本，进行蛋白质组学分析，获得差异表达蛋白，然后对筛选的差异蛋白进行验证，验证结果表明一些尿液外泌体蛋白，尤其是Annexin 2和Clusterin能够检测淀粉样β斑块沉积前的差异，这可能是预防AD的理想非侵入性生物标志物来源。
再回顾借鉴此文研究思路
Dr.Cell实验室根据研究者的不同需求，提供差异化的蛋白质组学技术服务以及外泌体整体服务方案。
关注逍鹏生物公众号→进入右下角“检测服务”→轻松下单
参考文献
Song Z, et al. Comprehensive Proteomic Profiling of Urinary Exosomes and Identification of Potential Non-invasive Early Biomarkers of Alzheimer's Disease in 5XFAD Mouse Model. Front Genet.2020;11:565479.
相关文章
更多 >