共聚焦显微镜以激光作为光源，激发组织细胞中荧光标记的分子和结构产生荧光信号，通过检测器收集信号从而进行高分辨率的成像。因此我们对不同荧光染料分别进行简单的介绍，帮助大家更快速地选择合适的染料。这一期我们将对内质网荧光染料进行简单的介绍。

内质网的概念

内质网是由扁囊、小管或小泡连接形成的三维网状膜系统，约占细胞总膜面积的 50%，是真核细胞中最多的膜，有粗面内质网（附着核糖体）和滑面内质网（未附着核糖体）两种形式，内质网在脂质合成和蛋白合成、蛋白伴侣和折叠以及钙稳态中具有核心作用。

1、DiOC6(3)内质网绿色荧光探针

DiOC6(3)(碘代3,3'-二己氧基羰花青) 是较为传统的内质网染色方式，它是一种亲脂性羰花青染料, 由两个苯并氧杂环通过共轭双键连接，每个环上连接两个己基（C6）链，其平面结构中的共振键导致正电荷离域，产生荧光特性，具有细胞膜透性。这种染料的激发/发射波长为：484/501nm。在高浓度（1-5μM）时，可穿透其他细胞膜，用来对活细胞和固定细胞的内质网进行染色。此外，DiOC6(3)在低浓度（10-20nM）时，会累积在线粒体（因线粒体有较高的负膜电位ΔΨm），因此也可用于检测活细胞的线粒体膜电位变化。

2、ER-Tracker内质网红/绿色荧光探针

ER-Tracker Red/Green是一种具有细胞膜通透性的内质网(endoplasmic reticulum, ER)红/绿色荧光探针，对内质网有高度选择性，可以用于活细胞内质网特异性荧光染色。ER-Tracker Red/Green为采用Molecular Probes公司的BODIPY TR进行了荧光标记的glibenclamide。Glibenclamide即glyburide（格列苯脲：一种磺酰脲酶），是一种2型糖尿病治疗药物，可以结合主要定位在内质网上的包含ATP敏感的钾离子通道(KATP channel)的磺脲类(sulphonylurea)受体。荧光标记的glibenclamide可用作内质网特异性的荧光探针。ER-Tracker Red呈红色荧光，检测时的最大激发波长为587nm，最大发射波长为615nm；ER-Tracker Green呈绿色荧光，检测时最大激发光波长为504nm，最大发射光波长为511nm。相比传统的DiOC6(3)染料对于细胞的毒性而言，ER-Tracker Red对于细胞的毒性极低。但这种染料适用于活细胞内质网的荧光染色，却不适合用于固定细胞内质网的荧光染色。

3、AIE-ER

AIE-ER 是一种特异性的内质网 (ER) 荧光探针 (绿色荧光，激发光波长为405 nm, 发射光波长为450~650 nm)，AIE-ER 探针中的分子在溶液中通常荧光较弱或不发光，但当它们聚集在内质网中时，由于分子内运动受限等原因，会诱导荧光发射增强，从而实现对内质网的特异性荧光标记。它的特点是具有优异的靶向特异性，能精准识别内质网；显著的光稳定性，不易发生光漂白；高亮度，荧光信号强；低工作浓度，可在较低浓度下实现有效标记，且对细胞的毒性较小。一方面可用于活细胞内质网的实时成像，便于观察内质网的形态、结构和分布变化，另一方面，可作为研究内质网相关疾病的工具，通过标记内质网，深入了解疾病的发病机制。

4、ER Flipper-TR 28

ER Flipper-TR 28 是一种带有小分子荧光基团的 Flipper 探针，可用于内质网（ER）膜张力成像。其结构中含有五氟.苯基基团，并且可以与内质网表面面向细胞质的蛋白质硫醇反应。ER Flipper-TR 28 探针通过其机械感受基团中两个扭曲的二噻吩并噻吩之间的扭转角度和偏振的变化来感知内质网脂质双层膜的组织变化，进而反映膜张力的变化。当内质网膜处于紧张状态时，二噻吩并噻吩呈并排状态，探针的发射寿命较长，为 4.1-8.0ns；而在松弛状态下，二噻吩并噻吩呈扭曲状态，发射寿命较短，为 2.0-4.0ns。它具有宽吸收和发射光谱，通常可以用 488nm 激光进行激发，发射光在 575-625nm 之间，能够自发地插入内质网的脂质膜中，且只在插入膜中时才会发出荧光，因此具有良好的靶向性和低背景荧光。此外，该探针适用于活细胞成像，对细胞的毒性较小。

5、内质网染色的应用

内质网染色技术通过特异性标记内质网结构，使我们能更直观地研究其形态、功能及病理状态，被广泛应用于细胞生物学研究、医学病理诊断、药物研发三大核心领域，同时在农业科学、环境科学等交叉领域也有延伸应用。

在细胞生物学基础研究方面，内质网染色能通过对其形态动态观察和亚细胞定位的研究，从而解析内质网形态与功能的关系。

在医学病理诊断方面，内质网染色技术能加深我们对内质网应激（ERS）与疾病机制的研究，通过观察应激状态下的内质网形态改变和应激通路验证来揭示病理状态下的内质网异常。

在药物研发方面，内质网染色技术能通过药物靶点验证和药物毒性检测来筛选药物靶点并检测药物的安全性，有效助力药物研发与其毒性评估。

A549细胞：

Dapi（405通道）

线粒体Mito-tracker（488通道）

内质网染料（555通道）
 

Merge

Hela细胞：

Dapi（405通道）
 

线粒体Mito-tracker（488通道）
 

内质网（555通道）
 

Merge

中心（公司）超高分辨率激光共聚焦显微镜平台搭建的Leica Stellaris 5超高分辨率激光共聚焦系统，具有22mm均匀大视场及8K超高清扫描分辨率两大优势，同时搭载Power HyD检测器，可实现更高的光子探测效率。整合的多层智能模块体系，包含精准自聚焦、全景拼图、多维时序成像以及光谱解码等功能组件，尤其配备专业级共定位分析与智能三维重构系统，通过模组化扩展设计持续赋能生命科学探索新边界。