细胞培养是生物医药科研工作者要掌握的基本技能，也是决定实验成败的关键环节。因此，了解细胞培养基本操作要领对于生物医药科研工作者，尤其是从事基础研究的科研人员尤为重要。本文将从实际操作角度谈谈体外细胞培养过程中的操作要领。

　　从脐带华通氏胶组织分离培养的原代细胞

　　1.实验前准备

　　正常细胞生长环境为5%二氧化碳，恒温37℃以及饱和湿度。开始进行细胞培养前，实验者要查阅资料，了解所要培养细胞的生长习惯，如贴壁、半贴壁、悬浮等。了解细胞生长的营养条件，大部分细胞是10%胎牛血清+89%培养基+1%抗生素。当然，培养基细分有很多种类，如高糖、低糖、分化培养基、干细胞培养基等。根据培养细胞的生长条件，预先选择合适的耗材，如促贴壁或低吸附培养瓶、培养皿、培养板等。在处理细胞前，算好本次处理所需的细胞生长培养基总量，生长培养基现配现用。

　　2.细胞消化

　　对于贴壁类细胞，传代相较于悬浮细胞操作步骤多，应避免不必要的细胞污染发生。细胞生长汇合度80-90%左右时即可进行传代操作。因为细胞生长有浓度依赖性，过完或过早传代都会影响细胞状态。培养箱取出细胞，PBS清洗2遍。这时要将细胞培养瓶中的液体吸净，可以用真空泵、移液管、一次性吸管等，但是无论用什么方式吸净，都要避免操作手触碰瓶口而造成污染，避免吸头触碰细胞面而对细胞造成机械损伤。吸净液体后，加入适量的胰蛋白酶。胰蛋白酶不宜过多，只需几滴，倾斜培养瓶后能将细胞面覆盖即可。此时可将细胞放在培养箱中，37℃的条件有助于胰蛋白酶发挥消化作用。消化时间在2分钟左右即可。当然有的细胞较容易消化，可能消化过程只需30秒，如TC-1、MC-38等肿瘤细胞株；有的细胞消化较慢，如原代培养的间充质干细胞(MSCs)。另外，如何判断细胞消化过程是否结束？我们可以在倒置显微镜下观察细胞形态，细胞大部分从多角形变为卵圆形，并见细胞漂浮。也可以通过肉眼直接观察细胞面由光滑向毛玻璃状变化。这是可以加入适量完全培养基终止胰蛋白酶消化，基本上加入3-5毫升即可。加入后轻轻吹吸后转移到离心管进行离心，基本上1000转离心3分钟细胞就能分离下来，转速不宜过高，否则会有细胞碎片跟着离心下来。离心结束后，弃上清液。这时可以直接倒，然后用移液枪把残留液体洗净。

　　3.接种

　　将以上得到的细胞沉淀重悬。可以借助漩涡震荡仪来重悬，也可以在重悬细胞前手指轻弹离心管底部，再加入适量培养基重悬，切忌直接加入培养基后用移液枪去吹打。重悬好的细胞均分到2-3个培养瓶中，补全生长培养基继续培养。T25瓶培养液总量8-10毫升左右，T75瓶培养液总量20-25毫升左右。接种后，十字混匀，并每天镜下观察细胞状态。细胞细胞传代比例是可以根据细胞生长规律调整的，如生长较快的肿瘤细胞株，可以按照1：5，甚至1：10的比例传代。当然原代分离培养的细胞生长较慢，可以1：2，甚至2：3传代。