方案摘要：本方案采用双抗体夹心法检测登革病毒 NS1 抗原，适用于发病 5 天内患者血清的早期诊断。以抗 NS1 单克隆抗体包被酶标板，结合待检血清中 NS1 抗原后，加入酶标记抗体形成复合物，经显色反应判读结果。操作中使用 Pipetty 电动移液器精准移取试剂，关键步骤包括包被、加样、酶标反应、显色及终止。结果以临界值判定阴阳性，显色强度与抗原含量正相关。该方法通过标准化操作提升检测准确性，可快速为登革热早期诊断、疫情监测提供依据，注意避免标本污染及与 Zika 病毒的交叉反应干扰。
  
方案详情：
一、实验原理
      在微孔条上预包被登革病毒的单克隆抗体，该抗体可与登革热病例血清中的登革病毒中的NS1抗原特异性结合，再与辣根过氧化酶标记抗NS1抗体试剂进行第二次温育，当样品中存在登革病毒NS1抗原时将形成“包被抗体-NS1-酶标抗体”复合物。加入显色剂，复合物上连接的辣根过氧化物酶催化显示剂反应，生成蓝色产物，终止反应后，变为黄色，若样品中无登革病毒NS1抗原则不显示。
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸头。
② 洗板机。
③ 酶标仪。
④ 恒温温箱。
⑤ 10mL吸管。
⑥ 稀释血清用的试管。
⑦ 吸水纸。
 
2、试剂和材料
① 登革病毒NS1抗原酶联免疫诊断试剂盒。
② 蒸馏水或去离子水。
 
三、实验步骤
1、将试剂盒在冰箱中取出，放置室温平衡 30min，使用前将试剂轻轻振荡混匀；
2、配液：将试剂盒中浓缩洗涤液用蒸馏水 20倍稀释；
3、编号：将样品对应微孔板编号，每板设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔；
4、加稀释液：使用Pipetty电动移液器，设置连续分液模式，每孔加稀释液 50uL，空白孔除外；
5、加样：更换新吸头，使用连续分液模式分别在相应孔加入待测样品或阴阳性对照各 50uL，空白孔除外；
 
6、温育：用封板膜封板后，置 37℃温育 60min；
7、每孔加酶标试剂 50uL，空白孔除外，轻轻振荡混匀；
8、温育：用封板膜封板后，置 37℃温育 30min；
9、洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后1次尽量扣干；
10、显色：每孔加入显色剂A、B液各 50uL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色 15min；
11、测定：每孔加终止液 50uL，10min 内测定结果。设定酶标仪波长于 450nm 处[建议使用双波长 450nm/(600~650)nm 检测]，用空白孔调零后测定各孔A值。
 
四、试验结果
临界值计算：临界值=0.10+阴性对照孔A值均值（阴性对照孔A值低于0.05者以0.05计算）。
阴性对照的正常值范围：阴性对照孔A≤0.1(若1孔A>0.1应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照>0.1，应重复实验)。
阳性对照正常值范围：A≥0.8。
阳性判定：样品A值多临界值者为登革病毒抗原阳性。
阴性判定：样品A值<临界值者为登革病毒抗原阴性。