方案摘要：本方案聚焦 Pipetty 电动移液器在基孔肯雅病毒核酸 RT-PCR 检测中的应用。其在病毒 RNA 提取时精准添加试剂，保障模板质量；配置反应体系用连续分液模式分装混合液；同时，其具备温度补偿功能、能减少人为误差，提升效率与准确性，且维护成本低、合规性强，为检测提供有力支持，保障结果的精准与可重复。该移液器提升了检测准确性与效率，为病毒检测规范化提供有力支持，是检测工作的重要工具。
 
方案详情：

• 实验原理

病毒RNA在逆转录酶的作用下先转录成模板cDNA，然后在聚合酶的作用下合成特异DNA片段，扩增主要由变性、退火和延伸三个步骤反复循环构成：即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37℃~55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在适宜温度下（72℃）经Tag酶催化，以引物3'端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成新的DNA链。
二、‌实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-250及配套吸头；
② 离心管（1.5m、0.2 mL 和 0.1 mL）；
③ 试管架（5 mL、1.5L 和 20  ）；
④ 高速冷冻离心机；
⑤ 旋涡混合器；
⑥ 恒温振荡器；
⑦ PCR 仪等。
 
2、试剂和材料
① CHIKV 特异性引物（ CHIKV-F，CHIKV-R）；
② RNA 提取试剂；
③ 一步法 RT-PCR 检测试剂；
④ CHIKV-F：5’-GGGCGGGTAGTCCATGTTGTAGA-3'
   CHIKV-R：5’-ACCGGCGTCTACCCATTCATGT-3'。
 
三、实验步骤
1、病毒 RNA 提取：待检标本用病毒 RNA 提取试剂盒提取，操作步骤按说明书进行，制备的病毒核酸作为 Real-time RT-PCR 的模板。此过程中可使用 Pipetty 电动移液器进行试剂的添加，如在使用离心柱法提取时，准确吸取裂解液、洗涤缓冲液等试剂加入到样本中。
2、配置反应体系，根据试验要求设置阴性、阳性、内参对照。根据需要检测的样品数量，配制反应体系。将混合液、引物、探针、水充分混匀后分装，使用 Pipetty 电动移液器的连续分液模式，设置每次分液量和连续分液次数，每管分液 15μL，转移反应管至样品制备区。
 
3、加入 RNA 模板：更换吸头，设置分液量和分液次数，吸取 RNA 溶液，在反应管中分别加入 5μL RNA，使每管总体积达到 20μL，记录反应管对应的样品编号。操作过程中，每次操作都要更换新的灭菌吸头，严防不同样品间的交叉污染。
4、一步法 RT-PCR 扩增：反应条件为：逆转录 50℃ 30 min；PCR 反应，94℃ 2 min 一次，再进行35个循环的94℃ 30s，57℃ 30 s，68℃ 40 s，最后再以68℃ 5 min 结束。该反应条件可根据不同的试剂进行适当的调整。
 
四、试验结果
RT-PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，如果条带的分子量与预期片段大小（330bp）相同，可判定CHIKV核酸扩增阳性。