方案摘要：动物布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属细菌引发的人兽共患传染病，对畜牧业及公共卫生危害巨大。多重 PCR 检测技术因能同时检测多种靶标，提升检测效率与准确性，在动物布鲁氏菌病诊断中应用广泛。Pipetty 电动移液器作为精准移液工具，在该检测流程中发挥着关键作用。其高精度移液性能可确保 PCR 反应体系中各类试剂，如引物、探针、DNA 聚合酶、缓冲液及模板 DNA 等的添加量精准无误，为反应提供稳定可靠条件，减少因移液误差导致的结果偏差。连续分液功能则在处理大量样本时显著提高移液效率，节省操作时间。此外，它还能有效规避手动移液因操作人员手法、力度差异造成的误差，保障实验的重复性与不同批次实验结果的可比性。同时，Pipetty 电动移液器具备的温度补偿功能，可校正因手部温度影响导致的分液量偏差，始终维持移液精度，尤其适用于长时间、大规模的动物布鲁氏菌病检测工作 。
 
方案详情：
一、实验原理
      多重 PCR 通过在同一反应体系中设计多对特异性引物，同时靶向布鲁氏菌属保守基因（如bcsp31、16S rRNA）及生物种特异性序列（如IS711），经变性、退火、延伸循环实现靶基因同步扩增。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳或荧光定量检测，根据特异性条带或荧光信号判断是否存在布鲁氏菌感染及菌种类型，兼具高效性与特异性，可同时完成病原鉴定与分型。
二、‌实验准备
1、设配和材料
① 恒温培养箱。
② PCR 扩增仪及配套的 PCR 反应管。
③ 电泳仪和电泳槽。
④ 凝胶成像系统或紫外透射仪。
⑤ 旋涡混匀器。
⑥ Ⅱ级生物安全柜。
⑦ 干式加热器。
⑧ 水浴锅。
⑨ 台式高速冷冻离心机（离心力≥12000g）。
⑩ 冰箱（2℃~8 ℃、-20 ℃，-80 ℃）。
⑪ Pipetty电动移液器0.1-20 μL、1-250 μL、5-1000 μL及无菌枪头。
 
2、试剂和材料
① 2×荧光 PCR 预混液（2×Buffer，含 0.05 U/μL, Taq 酶、0.4 mmol/L dNTPs 及4mmol/L 氯化镁)。
② ddH2O、PBS（0.1 mol/L，pH 7.4）。
③ 阳性对照,为参考菌株（牛种,羊种、猪种、犬种布鲁氏菌基因组以及 A19 和 S2疫苗株等）DNA，可使用 102CFU/mL~103CFU/mL的细菌 200 μL提取细菌 DNA。
④ 阴性对照，为ddH2O。
⑤ 细菌 DNA 提取试剂盒。
 
三、实验步骤
1、疑似布鲁氏菌分离株的灭活：在生物安全柜内，用接种环从培养皿上挑取单个疑似菌落或多个经纯培养的疑似菌落，加入含 200 uL的 PBS 或 ddH2O 的离心管中，使用Pipetty电动移液器，设置自动混匀功能，吹打均匀，密封管盖，置于干式加热器，80 ℃灭活 2h。
 
2、将全血样 、乳样、组织样、拭子样及液体样，进行处理后，置于干式加热器或水浴锅，80 ℃灭活2 h。
3、菌株及样品 DNA提取，可采用细菌 DNA 提取试剂盒，按说明书规定程序提取样品 DNA，也可采用酚-三氯甲烷-异戊醇抽提法，步骤如下：
a）使用Pipetty电动移液器取 200 μL 处理过的样品放入离心管，加入裂解液（10 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaC1，0.5% SDS，200 μg/mL 蛋白酶K）200μL，56 ℃消化2h，12000g离心 20s，取上清液置于另一个管中，然后加入等体积的酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1）混合物，上下颠倒3~4次混匀。
b）4℃ 7000g离心10 min，移上层液相置于另一个管中，加入 2.5倍体积预冷 70%（体积分数）乙醇，-20 ℃沉淀 30 min，12000g离心10 min，弃去液相，加入1mL 70%(体积分数）乙醇漂洗，12000g 离心 2 min~3 min，弃去液相，留取沉淀，真空或室温干燥，加入 20μL ddH2O，-20 ℃保存备用。
4、按表3配制反应体系，在 PCR反应管中依次加入以下成分，充分混匀后，瞬时离心，确保所有反应成分混匀并集于管底，使用 PCR 反应混合液时，将试剂稀释至工作浓度。
 
5、95 ℃预变性 5 min；然后 95 ℃变性 35s，64 ℃退火45 s，72 ℃延伸1min，进行 30 个循环；最后72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。
6、用 1XTAE 电泳缓冲液配制1.5% 琼脂糖凝胶，按每100 mL凝胶溶液加入10 μL的比例加入核酸染料，倒凝胶平板；取 PCR产物5μL与1μL溴酚蓝缓冲液，混合，加样;加 DNA marker 作为分子质量对照。5 V/cm~8 V/cm 电泳 1h，置凝胶成像系统或紫外透射仪上观察，拍照记录检测结果。
四、结果判定
1、阴性对照无特异性扩增产物，阳性对照有与分子质量相符的特异性扩增产物，试验成立。
2、按F.3的判定标准，待检验样品出现种特异扩增条带，则判定为相应的布鲁氏菌种:
a)扩增结果出现1682 bp 和 587 bp 两条电泳带时，判为牛种布鲁氏菌；
b)扩增结果出现1682 bp、1071 bp 和 587 bp 三条电泳带时，判为羊种布鲁氏菌；
c)扩增结果出现1682bp、1071bp、587bp和 272bp 四条电泳带时，判为猪种或犬种布鲁氏菌；
d)扩增结果出现1682 bp 一条电泳带时，判为A19 疫苗株;
e）扩增结果出现1071bp和587 bp 两条电泳带时，判为绵羊附睾种布鲁氏菌。