方案摘要：本方案主要探讨 Pipetty 电动移液器在基孔肯雅病毒核酸（蚀斑减少中和试验）检测中的具体应用。这款移液器拥有轻便小巧的特点，重量仅 75g，操作起来十分舒适。同时，它具备高精度的等量连续分液能力，能够按照设定的移液量进行多次重复排液，并且配备了温度控制功能，可避免因手部热量影响而导致的精度降低。在检测流程里，无论是样本稀释还是连续加样等关键步骤，该移液器都能发挥积极作用，有效提高检测效率与准确性，减少实验过程中的误差，为基孔肯雅病毒的检测工作提供坚实可靠的支持。
 
方案详情：
一、实验原理
       血清中CHIKV中和抗体可阻断病毒吸附细胞，而未被中和的病毒仍具有感染细胞的能力，可导致单层细胞病变、脱落等，形成一个局限性的变性细胞区，该区称之为蚀斑。在单层细胞上覆盖含有活性染料的营养琼脂可指示蚀斑的多少。“蚀斑”是感染了病毒的细胞，病变死亡后无法被染料染上颜色，形成空斑，而未感染病毒的细胞可被活性染料着色，通过颜色的对比可判定蚀斑量。检测血清的中和抗体时，需用已知蚀斑滴定度的参考毒株与待检血清反应，蚀斑数减少表示血清有中和活性，中和反应后能引起50%蚀斑减少的血清稀释度的倒数即为蚀斑减少中和抗体的滴度。蚀斑减少中和试验检测基孔肯雅病毒中和抗体实验应在BSL-3级实验室内进行。
 
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
① 4℃冰箱。
② 37℃水浴锅。
③ 二氧化碳培养箱。
④ 无菌平底6孔组织培养板。
⑤ Pipetty电动移液器MSIC01-02-1000及相应量程吸头。
 
1、试剂和材料
① 易感细胞：健康单层 Vero 细胞。
② 细胞生长液：100mL生长液中包含 Eagle'sMEM 溶液 88mL，10000IU/mL 青链霉素溶液1mL，1%谷氨酰胺1 mL，胎牛血清 10 mL用 7.5%碳酸氢钠溶液调至 pH 7.2，用前混匀。
③ 细胞维持液：100mL维持液中包含 Eagle'sMEM溶液 96 mL，10 000 U/mL， 青链霉素溶液1mL，1%谷氨酰胺1mL，胎牛血清 2 mL，用 7.5%碳酸氢钠溶液调至 pH 7.2，用前混匀。
④ 细胞消化液：2.5g胰酶溶于1000mL 无钙镁磷酸盐缓冲液中，过滤除菌。
⑤ 病毒储备液及其滴定：CHIKV 接种 Vero 细胞，待细胞出现细胞病理性效应(CPE)达+++后收获病毒，离心后将上清分装到无菌2mL 螺口血清管，冻存到-70℃冰箱作为病毒储备液备用。使用前先取一支病毒液进行病毒蚀斑形成单位(PFU)滴定。具体操作步骤为：
（a）准备3块已长成单层的 VER0细胞6孔细胞培养板，并编号;
（b）将病毒液用维持液做连续 10 倍稀释至 10-8，弃去细胞培养液，然后从最高稀释度起将各稀释度的病毒液加到 6孔细胞板中，每个稀释度加两孔，每孔 100μL，最后两孔作细胞对照，37℃吸附1h;
（c）准备 1%琼脂培养基，并使其保温在 43℃，病毒吸附结束后加入琼脂培养基到各细胞孔，每孔 3mL，轻柔摇晃混匀，确保琼脂将病毒液完全覆盖，大约20min后，琼脂完全凝固，将平板倒置放入 C02培养箱中，37℃培养；
（d）每天观察计数蚀斑量，并在细胞板的背面用记号笔圈出蚀斑；如果接种 10-4稀释度的病毒孔的蚀斑无法计数，接种 10-5稀释度病毒的两个细胞孔中平均有 100个蚀斑，那么病毒的滴度为107PFU /mL。
⑥ 其他试剂：阳性对照血清、阴性对照血清、待测血清标本、牛血清白蛋白(BSA)、PH7.4的 Tris缓冲液、琼脂糖、中性红。
 
三、实验步骤
1、待检血清在 56℃水浴灭活 30 min，除去血清中的补体和其他干扰因子。
2、使用Pipetty电动移液器，设置自动混匀功能，用含 1% BSA 的维持液稀释病毒至每100μL含有200个蚀斑单位(200 PFU/0.1 mL)。
 
3、使用自动混匀功能，用含 1% BSA 的维持液将待检血清先做1∶5稀释，然后做连续2倍稀释至 1∶160 或是所需要的滴度，并保证每个稀释度的工作容量为100μL。
4、取稀释好的 200 PFU/0.1 mL的病毒液100μL，分别加入100μL不同稀释度的血清中，自动混匀后，4℃孵育过夜，或者 37℃孵育 1h。
 
5、取稀释好的 200 PFU/0.1 mL的病毒液 500μL，加入等量的含1% BSA 的维持液，自动混匀模式，一键混匀，然后对病毒液做连续 10 倍稀释，包括:10-1 和 10-2，这些混合稀释液各自的最终病毒含量要达到 100PFU/0.1 mL、10 PFU/0.1 mL 和1 PFU/0.1 mL，最后对病毒液做回滴，并且病毒回滴液和病毒血清混合液在同样条件下孵育。
6、孵育结束后，先将6孔板中的单层细胞培养液吸出，然后加入病毒-血清混合液，设置连续分液功能，每次分液100微升，连续分液6次，每孔等量加入 100μL。用另外一块细胞培养板加入用于病毒回滴的病毒稀释液，各稀释度加两孔，37℃吸附1 h。
 
7、准备含中性红的1%琼脂或琼脂糖培养基，加热使其完全溶解后放置 43℃水浴使其保持液体状态备用，含有中性红染料的营养琼脂配方为：维持液中加1%琼脂和0.4%中性红。
8、将上述 1%琼脂培养基逐一加入病毒血清反应孔和病毒回滴孔中，每孔加入3mL，轻柔摇晃混匀，确保琼脂将病毒-血清混合液完全覆盖。
9、大约 20 min 后，琼脂完全凝固，将平板倒置放入C02培养箱中，37℃培养。每天观察计数蚀斑量，并在倒置的平板上用记号笔圈出蚀斑。
四、结果判读
1、病毒回滴试验是为了确定加入的病毒量是否合适，计算病毒回滴试验中的蚀斑数，计算平行孔中的蚀斑数平均值，只有蚀斑量在 30~100之间时才计算试验孔中的蚀斑量，最后计算中和抗体滴度。
2、阳性血清对照成立，测定抗体滴度在已知抗体滴度的上下一个稀释度范围内；同时检测细胞对照孔，对照孔细胞形态正常则所做试验结果可靠。只有试验孔出现 90%的蚀斑量减少现象才可判定出现了免疫中和反应。比如，逆滴定表明己知攻击病毒滴度为 100 PFU/0.1 mL，那么≤10个蚀斑量的血清稀释度就是终点。
3、能中和病毒的最高血清稀释度的倒数就是蚀斑减少中和抗体滴度。