方案摘要：本方案聚焦 Pipetty 电动移液器于新城疫 RT-PCR 检测的应用。通过其高精度移液，在样本处理阶段精准转移 RNA 模板，确保逆转录起始模板量稳定；PCR 扩增环节，凭借连续分液等多种模式，高效完成多试剂添加，精准控制珍贵试剂用量，提升反应特异性与灵敏性。此外，Pipetty整机重量不到75g，相比同类型移液器，可以有效减轻操作人员的手部疲劳，温度传感器保障移液精度不受环境干扰。相比手动移液器操作，该移液器显著提升检测效率，降低误差，为新城疫快速、准确诊断提供可靠支持。
 
方案详情：
一、实验原理
     新城疫由新城疫病毒引发，RT-PCR 技术检测新城疫，先提取病毒 RNA，在逆转录酶作用下合成 cDNA。再基于 DNA 半保留复制，通过高温变性解旋双链，低温退火使引物与 cDNA 结合，适温延伸由 DNA 聚合酶合成新链。经 30 - 40 个循环，微量病毒核酸大量扩增，最后用电泳、荧光定量等方法检测扩增产物，出现特异性条带或达荧光阈值，即表明样本含新城疫病毒。​
二、‌实验准备
1、设配和材料
① PCR扩增仪。
② 台式高速冷冻离心机。
③ Ⅱ级生物安全柜。
④ 电泳仪。
⑤ 电泳槽。
⑥ 紫外凝胶成像仪。
⑦ Pipetty电动移液器1-250、5-1000、1-10ML量程。
 
1、试剂和材料
① RNA提取试剂 Trizol。也可用商品化RNA提取试剂盒，或其他等效RNA提取试剂和方法，如自动化核酸提取仪和其他配套核酸抽提试剂进行核酸提取。
② 三氯甲烷(氯仿)。
③ 异丙醇(分析纯)。
④ 75%乙醇：用新开启的无水乙醇（分析纯）和DEPC处理水按3:1配制而成，-20℃预冷。
⑤ RT-PCR相关试剂：可选择商品化试剂盒。
⑥ 阳性对照：灭活的新城疫强毒感染鸡胚尿囊液。
⑦ 阴性对照：SPF鸡胚尿囊液。
 
三、实验步骤
1、取处理后的拭子样品、组织样品或尿囊液3000r/min离心5min，取200μL离心后的上清提取RNA。
2、病毒 RNA 提取
RNA提取应保证无细菌及核酸污染，实验材料和容器应经过消毒处理并一次性使用。提取RNA时应避免RNA酶污染。用Trizol提取核酸RNA的操作步骤如下:
a) 在无RNA酶的1.5 mL离心管中加入 200μL检测样品，然后加入1mL Trizol，振荡20s，室温静置 10 min。
b)加入 200 μL三氯甲烷（氯仿），颠倒混匀，室温静置10 min，12000r/min离心 15 min。
c)管内液体分为三层，取500μL上清液于离心管中，加入500μL预冷(-20℃)的异丙醇，颠倒混匀，静置10min。12000r/min离心 15 min沉淀RNA，弃去所有液体（离心管在吸水纸上控干）。
d)加入700μL预冷（-20℃）的75%乙醇洗涤，颠倒混匀2次~3次。12000r/min 离心10 min。
e)调水浴至60℃。离心管在室温下干燥至没有水滴。加入40μL DEPC处理水，60℃水浴中作用10min，充分溶解RNA，-70℃保存或立即使用。
3、 配置RT-PCR反应体系
引物针对新城疫病毒F基因设计:

• 上游引物P1的序列为5'-ATGGGCYCCAGAYCTTCTAC-3';
• 下游引物P2的序列为5'-CTGCCACTGCTAGTTGTGATAATCC-3';
• Y为兼并碱基(Y：C/T)。

4、RT-PCR反应体系配置见表1。体系配好后盖紧PCR反应管盖，并做好标记。
 
5、使用Pipetty电动移液器，设置连续分液模式，按加样顺序全部加完并做三个复孔后，充分混匀，瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。同时设立阳性对照和阴性对照。按照下列程序进行扩增：42℃反转录30min；95℃预变性3min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s，共进行 35次循环；最后，72℃再延伸7min。最终的 RT-PCR产物置4 ℃保存。
 
6、扩增产物电泳检测， 1.5%琼脂糖凝胶板的制备：称取1.5g琼脂糖，加入100mL1×TAE缓冲液中。加热融化后加5μL(10 mg/mL)溴乙锭，混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔)，放入电泳槽中，加1×TAE缓冲液淹没胶面。
7、加样：用Pipetty取5μLPCR产物与0.5μL 10×加样缓冲液混匀后加入琼脂糖凝胶板的一个加样孔中每次电泳同时设标准DNA Marker、阴性对照、阳性对照。
8、电泳：接通电源，120V恒压电泳30 min~40 min。
9、电泳结束后，取出凝胶板置凝胶成像仪（或紫外线透射仪）上观察并记录结果。
五、结果判定
1、试验成立条件：阳性对照出现535bp左右扩增条带，同时阴性对照无扩增条带。
2、检测样品出现535bp左右的目的片段（与阳性对照大小相符），判为新城疫病毒核酸阳性；
3、检测样品未出现目的片段，判为新城疫病毒核酸阴性。
六、NDV强毒感染的确定
对扩增到的目的片段进行序列测定，根据序列测定结果，对毒株F基因编码的氨基酸序列进行分析。如果毒株F2蛋白的C端有“多个碱性氨基酸残基”，F1蛋白的N端即117位为苯丙氨酸，可确定为新城疫病毒强毒感染。”多个碱性氨基酸“是指毒株F2蛋白的C端在113位到116位残基之间至少有三个精氨酸或赖氨酸。