方案摘要:登革热肆虐全球,及时诊断对诊疗和防控至关重要。本方案基于抗原 - 抗体特异性结合原理,利用荧光标记技术检测病毒抗原或抗体(IgM/IgG),以血清为样本,经处理、孵育、洗涤后,通过荧光显微镜判读结果。检测过程中,Pipetty 电动移液器优势显著,其内置温度传感器,可依温度自动校正分配量,排除手温干扰,保障移液精度;连续分液功能可将设定液量多次等量排出,大幅提升 96 孔板等加样效率。提高早期检测效率,助力疫情控制,保障公众健康。
方案详情:
一、实验原理
某些荧光素(常用异硫氰酸荧光素)能与抗体蛋白分子结合,而不丧失抗体活力,仍能和相应的抗原发生特异免疫反应,产生免疫复合物,这种复合物由于有荧光色素的参与,在荧光显微镜下显示荧光,表明有特异性抗原存在。直接免疫荧光法可用于检测感染细胞内的特异性抗原,间接免疫荧光法可查待检血清中的特异性抗体。
二、
实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸头;
② 荧光显微镜。
2、试剂和材料
① 登革病毒 1~4 型抗原片(登革标准毒株感染 BHK、Vero 或 C6/36细胞制备,低温干燥保存)及相应单克隆抗体(阳性对照)、阴性血清;
② 羊抗人(免抗人)IgG荧光抗体;
③ 待检患者血清(急性期和恢复期);
④ 常用稀释液:pH7.2~7.4PBS、伊文斯兰、封片胶等;
三、实验步骤
1、取出抗原片,冷风吹干;
2、用 PH7.2~7.4 PBS 稀释待检血清,使用Pipetty自动混匀功能,从1∶20开始,对倍稀释至所需稀释度;
3、用Pipetty依次从高稀释度向低稀释度逐个加入稀释的待检血清于四个型的登革病毒抗原片孔中,每型各加2孔待检系列稀释血清,血清量以完全覆盖抗原面而不溢出孔外为准,置湿盒内,在 37℃水浴孵育 30min(每次试验同时作阴、阳性对照);
4、用 pH7.2~7.4 PBS 漂洗3次,每次约 30s~1min,再用蒸馏水洗1次,冷风吹干;
5、用 pH7.2~7.4 PBS 稀释荧光抗体,使其内含 2个工作单位和 1∶8000 伊文斯兰的荧光抗体,加入各孔中,使完全覆盖抗原面,置湿盒中,37℃水浴作用30min,取出,同上漂洗及吹干;
6、用封片胶(或甘油缓冲液)封片,荧光显微镜观察结果。
四、试验结果判读
特异性荧光呈黄绿色颗粒,分布在感染细胞浆中。根据荧光亮度和阳性细胞在细胞总数中所占的比,无荧光者为“-”。检测抗体滴度时,以特异荧光达“++”例可将荧光反应大致区分为“+~++++”最高血清稀释度的倒数表示。