（一） 前言

人类 T 细胞可以靶向肿瘤特异性的突变是癌症免疫治疗的基础， 如 Keytruda、 Opdivo这类 PD-1 靶向的药物和 Yervoy 这类 CTLA-4 靶向的药物，在临床上都展示出显著的疗效。但目前对这些药物有效的患者只占所有患者的大约 1/3，临床都是通过 IHC 检测肿瘤组织切片，来判断 PD-1 等靶点的表达量，从而判断是否适用这些药物。而获取肿瘤组织切片是侵入性的，很多情况下无法获得（某些内部器官，如肝、肺等部位的组织采样成功率很低）；如果肿瘤已被切除，那么后续就无法重复取样，也就无法进行追踪检测。 因此， 获取这些对肿瘤有反应性的 T 细胞是一个挑战。 新的研究发现从肿瘤患者的外周血里也可以分离得到肿瘤突变特异性的 T 细胞，有助于免疫治疗的进一步研究【1】。

台湾 MiCareo 公司的 MiSelect R“稀有细胞高效获取分析系统” 是目前一款集稀有细胞（包括“循环肿瘤细胞 CTCs” 、“稀有免疫细胞”等）富集与鉴定于一体的全自动化设备，可以从肿瘤患者的外周血里检测到对肿瘤有反应性的稀有免疫细胞，从而评估免疫治疗对患者的疗效， 并有助于免疫治疗的进一步开展。

（二） 免疫治疗研究进展

2.1 PD-1+CD8+ T 细胞是攻击肿瘤细胞的主要族群美国 NIH 的科学家研究发现如下结论，见图 1-5【2】。
 

图 1. 对于攻击肿瘤细胞的 CD8+ TILs 细胞， PD-1+是表达多的族群（32.4%），其次是
TIM-3+（13.0%）、 4-1BB+（10.8%）、 LAG-3+（5.7%）【2】。
 

图 2. PD-1 和其他 4-1BB、 LAG-3、 TIM-3 受体在 CD8+ TILs 细胞中有共表达性，显然 PD-
1+是主要的族群【2】。



图 3. 在新鲜肿瘤组织中， TIM-3+、 LAG-3+、 4-1BB+的细胞，大多数表现出 PD-1+，如
82.8%的 TIM-3+表达 PD-1、 79.3%的 LAG-3+表达 PD-1、 78.6%的 4-1BB+表达 PD-1，说明
PD-1+仍然是主要的族群【2】。

图 4. 不管 4-1BB 是阴性还是阳性， 只要 PD-1 阳性， 有 PD-1+的 TILs 细胞在和肿瘤细胞系
共培养时，对肿瘤细胞就有溶菌作用【2】。

图 5. PD-1 的表达决定了对肿瘤有反应的 CD8+ TILs 细胞的数目：对 PD-1+/4-1BB+的 CD8+TILs 细胞，对肿瘤有反应的百分比高，其次是 PD-1+/4-1BB-的 CD8+ TILs 细胞，反应比例小的是 PD-1-/4-1BB-的 CD8+ TILs 细胞【2】。

2.2 PD-1+CD8+ T 细胞比例高的人，对免疫治疗反应较好对非小细胞肺癌患者，用 PD-1 免疫阻断剂治疗时， PD-1+CD8+细胞比例高的人，对免疫治疗反应较好【3】，见图 6-7。

图 6.对于免疫治疗有反应的患者， PD-1T （高表达） TILs 细胞在所有细胞中的比例和单位面积的数量均高于没有反应的患者【3】。
 

图 7. PD-1T （高表达） TILs 细胞＞1%的患者，总体生存率（OS）要高于＜1%的患者【3】。

2.3 液体活检研究稀有免疫细胞

以往 TILs 的分离仅能从肿瘤组织中获取，但组织切片的获取具有很多不便性及侵入性。现在， 与肿瘤组织内部的 TILs 细胞一样，在患者的外周血里也能发现与 TILs 一致的 PD-1+CD8+的 T 细胞（图 8）。 肿瘤细胞的刺激使淋巴系统产生大量的功能性免疫细胞，再运送到肿瘤组织周围，所以在外周血中就可以获取与 TILs 一致的免疫细胞。 研究外周血循环中的 CD8+ T 细胞上的 PD-1 表达，为研究肿瘤组织内部的抗肿瘤 T 细胞提供了一扇窗户，也成为进行免疫治疗的标志物， 有助于分离出对肿瘤有反应的 CD8+ T 细胞，进行免疫治疗【1】。

图 8.外周血循环中可以分离出新抗原特异性的 PD-1+ T 细胞【1】。

2.4 流式细胞仪很难检测到外周血中的稀有免疫细胞

图 9. 在黑色素瘤患者的外周血中，也能发现新抗原特异性的淋巴细胞。与肿瘤组织内部
 

相比，外周血（PBMC）中的 PD-1+CD8+的 T 细胞数量非常少，流式细胞仪几乎无法检测到【4】。

（三） MiSelect R 检测稀有免疫细胞

3.1 MiSelect R 的高灵敏度

由于 MiSelect R 的创新性设计， 其对稀有细胞的捕获和鉴定具有高特异性和高灵敏度， 对于细胞数很稀少的族群 (<100 cells/mL) ， 流式细胞仪已经无法检测到，而MiSelect R 可以检测（图 10）【5】。 因此可以用 MiSelect R 来检测极微量的外周血中的稀有免疫细胞。
 

图 10. 对于细胞数很稀少的族群 (＜100 cells/mL) ， 流式细胞仪已经无法检测到，而MiSelect R 可以检测到； 而对于＞100 cells/mL 的族群， MiSelect R 检测到的细胞数量，几乎是流式的 2 倍以上，说明 MiSelect R 的灵敏度比流式更高【5】。

3.2 外周血稀有免疫细胞数量对疗效的影响
 

科学家研究了“肝细胞癌”和“肾细胞癌”的 anti-PD1（Keytruda） 免疫治疗， 对 36名“肝细胞癌”患者和 10 名“肾细胞癌”患者， 在免疫治疗之前抽取患者的外周血， 用MiSelect R 检测稀有免疫细胞的数量。实验结果表明： 外周血里稀有 PD-1+CD8+ T 细胞和PD1+CD4+ T 细胞数目多的患者，其总生存率（OS）和无进展生存率（PFS）均明显高于此类稀有 T 细胞数目少的患者（图 11-13）【5】。
 

图 11.肝细胞癌患者的外周血稀有 PD-1+CD8+ T 细胞（攻击性 T 细胞） 数目与 OS 的关系【5】。


图 12.肝细胞癌的外周血稀有 PD-1+CD8+ T 细胞（攻击性 T 细胞） 数目与 PFS 的关系【 5】。



图 13. 肾细胞癌的外周血稀有 PD-1+CD4+ T 细胞（调节性 T 细胞） 数目与 PFS 的关系【 5】。

3.3 其他免疫检查点抑制剂的研究

目前针对免疫检查点抑制剂的临床研究的统计结果如图 14，可见有部分研究是针对稀有的免疫检查靶点的，如 TIM-3、 LAG-3、 VISTA、 KIR， 因为 MiSelect R 是通过抗体来标记免疫细胞上的 marker， 所以 MiSelect R 均可有助于此类实验的开展【6】。
 

图 14. 免疫检查点抑制剂的临床研究的统计结果【6】。

3.4 MiSelect R 检测稀有免疫细胞的影像

图 15. MiSelect R 检测结直肠癌患者的稀有免疫细胞的影像，可见可以针对 IFN-r、 TIM-

3、 LAG-3 靶点进行标记【5】。

（四） MiSelect R 介绍

台湾 MiCareo 公司的 MiSelect R“稀有细胞高效获取分析系统” 是目前一款集稀有细胞（包括“循环肿瘤细胞 CTCs” 、“稀有免疫细胞”等）富集与鉴定于一体的全自动化设备，技术法宝包括微流控技术、激光分选、体积过滤和荧光标记成像，既可以对稀有细胞进行计数、分析和鉴定（生物标志物分析），又可以获得高捕获率、高纯度、高活性的稀有细胞，供下游研究使用。

MiSelect R 的原理见： 稀有细胞检测的突破——MiSelect R 助力稀有免疫细胞检测。

图 16. Miselect R 稀有细胞高效获取分析系统，全自动，省时省力。

（五） 总结

和市面上其他稀有细胞检测方法不同， MiSelect R 可对稀有细胞进行计数、分析、鉴定，并获得活细胞。具有高纯度（>60%） 、高捕获率（98.5%） 、高细胞活性（>99%） 、 高检测灵敏度、 可重复性（CV<10%） 、可视性、 广谱性以及全自动运行（操作简单，全血上样，全自动运行，单机集成）等优点，可检测 EpCAM 低表达的肿瘤细胞株，灵敏度是流式细胞仪的 2 倍。可用于 CTCs 研究、癌症药物的伴随诊断、稀有功能性免疫细胞研究，或产前无创检测，是非常强大的稀有细胞高效获取分析系统。

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参考文献：
【1】 Schumacher,T.N.& Scheper,W., A liquid biopsy for cancer immunotherapy,
Nature Medicine, Volume22, No.4, 2016, pp.340-341.
【2】 Gros,G.,et al., PD-1 identifies the patient-specific CD8+ tumor-reactive
repertoire infiltrating human tumors, The Journal of Clinical
Investigation, Volume124, No.5, 2014, pp.2246-2259.
【3】 Thommen,D.S.,et al., A transcriptionally and functionally distinct PD-1+
CD8+ T cell pool with predictive potential in non-small-cell lung cancer
treated with PD-1 blockade, Nature Medicine,
https://doi.org/10.1038/s41591-018-0057-z.
【4】 Gros,A.et.al., Prospective identification of neoantigen-specific
lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients, Nature
Medicine, published online 22 February 2016.
【5】 MiCareo Clinical Project Documents.
【6】 Website: ClinicalTrials.gov