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基于磁珠的半自动、非接触式和无移液吸头的 DNA 纯化

2022-12-08     来源:波士顿富默乐     点击次数:2145

摘要
由于基于磁珠的核酸纯化的易用性和可扩展性,其是过滤和离心方法的更好替代方法。磁珠悬浮液的颗粒性质和高粘度使得研究人员难以使用传统的吸头移液器对其进行移液。此外,为避免磁珠残留和交叉污染,使用接触式移液还会增加移液吸头消耗,从而导致高运营成本和塑料浪费。我们在此介绍一种改进的半自动化工作流程,使用 MANTIS® 搭配 Blue®Washer 纯化核酸,解决了传统移液的痛点。
 
介绍
 基于磁珠的提取方法采用简单的结合-洗涤-洗脱过程来分离和纯化核酸。 当添加磁珠时, 磁珠可逆地结合到感兴趣的分子上,将其从液相中移除。含有未结合杂质的剩余液体,可以通过清洗磁珠进行有效地去除。结合的纯化核酸可用于下游加工。对于传统的聚合物或无机磁珠,液相与磁珠的分离依赖于通过离心使磁珠沉降。
 
由于磁 (Mag) 珠具有超顺磁性核心,可在外部磁场中被磁化,因而可以使用永磁体取代离心机将其制成颗粒。这样的主要优势是在磁场被移除之前,珠粒能够保持固定,而且简化了移液并使过程更加自动化。
 
磁珠的大小范围从几纳米到几微米不等。由于磁珠大小与核心密度相联系,所以磁珠悬浮液不稳定。为了解决这个问题,在粘性液体中放入磁珠,以保持它们悬浮并防止在使用过程中快速沉淀。高粘度稳定剂会造成磁珠难以被移液,这是因为它们会粘在移液吸头上并需要液体类别优化。在磁珠分液过程中,传统的基于移液吸头的移液器可能会导致磁珠体积不均匀,从而影响产量。同时,移液过程中的接触会造成洗涤步骤中的高残留量或微珠损失,从而降低纯度或产量。同样,为避免微珠残留和交叉污染,接触式移液过程的每个步骤都需要一套干净的移液吸头,这会增加吸头消耗、运营成本和塑料浪费。
 
我们概述了半自动、非接触式和无移液吸头的 DNA 清理工作流程,在此过程中我们使用 MANTIS 分配 AMPure XP 珠子(Beckman Coulter,目录号 A63880)以及使用 BlueWasher 进行清洗步骤,有效解决了上述限制。
 
仪器
 MANTIS®
 
MANTIS 是一种非接触式高精度分液器,其死体积很低(图 1)。这些关键功能由称为“芯片”(表 1 中的规格)的独特微流体泵实现。低容量 (LV) 和高容量 (HV) 芯片可以使用移液器吸头作为输入源来对价格昂贵的试剂进行分液。
 
 
 
MANTIS 的芯片可以处理高达 25 厘泊 (cP) 的液体,相当于室温 (RT) 下 70% 的甘油溶液 [1]。与平均 AMPure 微珠 (1 μm) 相比,处理这种粘度和芯片流体通道 (380 μm) 直径的能力能让微珠均匀分配到多孔板上。此外,MANTIS 可以防止微珠沉降,因为珠子可以从放置在摇床/旋转容器上的离心管中分配,以实现均匀悬浮。
 
MANTIS 软件的一个独特功能是内置的浓度归一化向导。它即时执行必要的计算,从读板机导入标准数据输出。
 表1: MANTIS 芯片参数
 
Blue®Washer 
 BlueWasher 是一种非接触式、无移液吸头大体积液体分液器和微孔板清洗机(图 2)。通过针头歧管添加流体以进行清洗,而液体排空则通过离心技术而非吸液来完成。微量滴定板位于对称转子中,孔朝外以排出液体。板绕水平轴旋转,液体通过离心力从孔中去除,通过被动排水管离开转子室。对于磁珠 DNA 清理,磁性载体在液体离心抽空过程中保留磁珠。离心排空可减少残留体积(0.01 μL/孔)和细胞/微珠洗涤过程中的变异性。
 
工作流程
与 MANTIS 和 BlueWasher 的组合(图 3)相比,我们展示了使用多通道移液器进行基于磁珠的 DNA 清理。 
 
图 3. (a) 基于磁珠的 DNA 纯化的基本工作流程,
(b) 使用 MANTIS 和 BlueWasher 的半自动化过程
 
我们计划的工作流程展示了可以合并 MANTIS 和 BlueWasher 的步骤。
  1.  使用 MANTIS 将 AMPure 微珠分配到样品板的每个孔中。
  2.  放入微珠并使用 BlueWasher 排空上清液。
  3.  使用 BlueWasher 清洗微珠两次。
  4.  使用 MANTIS 向每个孔中添加洗脱缓冲液。
  5.  用传统的移液器转移洗脱样品。
  6.   DNA 量化后,使用 MANTIS 执行浓度归一化。
 
总结
 磁珠是提取和纯化核酸的有效手段。传统的移液可能会导致磁珠的分配不均匀,从而导致缺乏重现性。相反,MANTIS 精确分配高粘度液体的能力能够均匀分配磁珠。使用 BlueWasher 通过离心排出液体来清洗珠子可防止珠子残留并最大限度地减少残留体积(至 10 nL /孔)。此外,这两种产品的无移液吸头技术降低了运营成本和塑料浪费。此外,MANTIS 的浓度归一化向导进一步简化了工作流程。
 
总体而言,此工作流程仅保留一个传统的移液步骤来转移洗脱的样品,从而节省了约 500 个吸头/微孔板。动手时间和技巧成本减少了 83%(表 2)。虽然我们以手动移液为例说明了非接触式工作流程的好处,但在由传统液体处理程序自动化的基于磁珠的工作流程中,可以预期类似的成本降低。
 表 2:手动和半自动 DNA 清理的比较
 
致谢
我们要感谢 BlueCatBio 的 Frank Feist 在开发本应用说明时提供的支持。BlueCatBio 的成立宗旨是干净的数据等于有前途的药物发现。” Blue®Washer 是 BlueCatBio 的注册商标;欲了解更多信息,请访问 www.bluecatbio.com
 
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